淋巴細胞免疫治療應用于反復種植失敗的機制探討

譚艷 楊章莉

胚胎的成功種植，依賴于胚胎質量、子宮內膜容受性和免疫因子等多方面的因素。具有良好發育潛能的胚胎被放入宮腔后，著床位點產生的免疫反應介導胚胎的入侵，同時母體產生的免疫耐受又保證了胚胎這個半同種異體抗原不被排斥，而繼續維持妊娠。但是不適當的免疫調節會導致多種生殖障礙，如反復種植失敗、復發性流產等。胚胎移植3次及以上或者移植10個及以上的質量良好胚胎均未能妊娠，被稱為反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)，這是體外受精-胚胎移植過程中的棘手問題。近年來，采用淋巴細胞免疫治療來提高RIF患者的妊娠結局，正日益受到關注，下面對其可能的免疫學機制做一綜述。

一、植入和妊娠早期的免疫過程

現代生殖免疫學證明，胎兒-母體界面的免疫變化和周圍免疫反應參與誘導母體耐受反應，在某些生殖障礙的情況下，免疫細胞的功能和/或數量發生了改變[1]。調節T細胞(Treg)、自然殺傷細胞(NK)、巨噬細胞和輔助T細胞(Th)中的Th1、Th2、Th17是調節母體耐受和防止胎兒排斥的主要免疫細胞[2]。巨噬細胞和子宮特異性自然殺傷細胞(uNK)是蛻膜期的主要白細胞，在月經前期，子宮內膜的主要白細胞為炎性細胞，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞。接下來，將巨噬細胞、Th1/Th2平衡、Th17/Treg平衡、炎癥因子和趨化因子在維持妊娠中的作用，做簡要概述。

1.巨噬細胞：巨噬細胞包含20%的子宮內膜白細胞，存在于子宮內膜增殖、分化和脫落期。這些細胞通過產生生長因子、細胞因子和蛋白酶來創造一個局部的微環境。在最初的子宮內膜剝脫跡象出現之前，炎性白細胞進入子宮內膜基質和局部分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)，開始細胞外基質分解并觸發炎癥級聯反應，最終導致子宮內膜脫落。

2.Th1 / Th2平衡：妊娠期，免疫系統從Th1向Th2反應傾斜，有利于保護胎兒不受母體免疫系統的影響。Th1和Th2細胞是CD4+T細胞的主要亞群，它們在免疫反應中的獨特功能，與其獨特的細胞因子分泌模式有關。為了解釋調控Th1/Th2平衡的可能機制，有人提出胎兒誘導Th0細胞(幼稚T細胞)選擇Th2通路成熟，然后產生的Th2也有助于降低Th1的免疫反應[3]。

3.Th17 / Treg平衡：Th17細胞在排斥胚胎抗原中起著主要作用，因此不利于維持妊娠。母體對胎兒的耐受性完全取決于Treg和Th17細胞之間的精細平衡，如果平衡改變，會導致妊娠出現問題，如復發性流產[4]。

4.炎癥因子和趨化因子：白細胞募集過程中，白細胞介素8(IL-8)、單核細胞趨化蛋白3、嗜酸細胞紫杉醇、巨噬細胞炎性蛋白1、巨噬細胞衍生趨化因子等人類子宮內膜的趨化因子，在不同的階段具有動態表達水平[5]。趨化因子水平的異常改變可能導致不同白細胞的異常聚集，從而擾亂妊娠或月經。劉洋虹等[6]研究發現，RIF患者經宮腔灌注自體外周血單個核細胞(PBMCs)治療后得到了較高的臨床妊娠率(47.2%)；宮頸分泌物中的白細胞介素6(IL-6)，及其與腫瘤壞死因子α(TNF-α)的比值均顯著升高(P<0.05)。禹果[7]認為PBMCs可以有效地提高子宮內膜容受性標志物白血病抑制因子(LIF)和整合素αVβ3的表達，上調子宮內膜容受性，有利于胚胎著床。

二、LIT誘導產生的免疫因子

保護妊娠的淋巴細胞免疫治療(Lymphocyte immuntherapy，LIT)是將來自丈夫或無關第三者的外周血淋巴細胞注射入準媽媽體內，以準備免疫系統對胚胎抗原的耐受[8]。

據報道，大約81%的RIF患者存在子宮內膜異常情況，其中56.6%的患者有過度免疫反應，25%的患者有低免疫反應[9]。雖然RIF的基礎機制尚未完全闡明，但有人提出以下假設來描述同種異體免疫的積極作用：細胞因子產生模式的改變，抗特殊型抗體(Ab2)的產生[10]、混合淋巴細胞反應封閉抗體的表達(MLR-BF)[11]，抗父細胞毒性抗體的產生(APCAs)[12]，以及孕激素誘導的阻斷因子(PIBF)的表達[13]。LIT誘導產生APCAs、MLR-BF和Ab2，這些抗體可覆蓋胎兒表面的父系HLA，從而防止母體NK細胞和T細胞的攻擊。此外，LIT顯著減少Th1和Th17，并增加Th2和Treg細胞水平，因此導致Th2和Treg產生的細胞因子增加，比如IL-10、IL-4HE和TGFβ，這些有助于成功妊娠，而減少Th1和Th17分泌的細胞因子，如INF-γ和TNF-α，這些因子不利于妊娠。總體來說，LIT調節了母親的免疫系統以保護胎兒，使懷孕成功。

1.封閉抗體：封閉抗體(BAb)是成功妊娠的重要因素，通過抑制基質細胞毒性T細胞對胎兒起保護作用。BAb也可以阻止針對胎兒抗原產生的細胞介導免疫(CMI)。在正常妊娠期婦女中，在滋養細胞發育過程中會產生BAb，而在RIF患者的滋養細胞中，這一過程被破壞了。已發現父系淋巴細胞進行免疫治療的患者可以促進BAbs的產生，誘導妊娠成功。Hua等的Meta分析結果顯示，LIT之后BAb陽性患者的懷孕率明顯高于BAb陰性患者(P<0.001)[14]。

2.混合淋巴細胞反應封閉抗體：研究表明，混合淋巴細胞反應封閉抗體(MLR-BF)陽性患者，其術后順利懷孕的幾率明顯高于陰性患者。因此，是否存在MLR-BF可以作為免疫治療的標準之一。另一方面，幾乎所有的患者，MLR-BF都可以用其丈夫的淋巴細胞進行免疫治療后被誘導產生。自然獲得的MLR-BF可能是由于母系源性抗原導致的，也可能是由于接觸了精液而導致的。Pandey等[11]的結果證實，對于復發性流產患者，接受父系淋巴細胞免疫的婦女，其MLR-BF水平顯著高于接受自體或無關第三者淋巴細胞免疫的婦女。

3.Th-1和Th-2相關趨化因子受體的表達：LIT可能改變NK和T細胞的比例，或Th1和Th2相關趨化因子受體的表達，從而為胚胎植入提供合適的免疫環境[15]。已經證實，Th2產生的細胞因子，如IL-10和IL-4，有助于成功懷孕，而來自Th1的細胞因子，如干擾素-γ(IFN-γ)和TNF-α則產生不良的影響。此外，研究表明，在懷孕的前三個月，TNF-α的產生受到抑制，并且在妊娠8個月之前，TNF-α不會顯著增加。Gharesi-Fard等[16]的發現強調了上述LIT機制，該研究認為，LIT導致了IFN和TNF的大量減少，LIT可能對治療前TNF-α濃度高于400 pg/ml的患者有更有利的影響。因此，評估TNF-α是可以接受免疫治療的患者的另一個標準。

在RIF患者中，Th1/Th2的不平衡導致了IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平的增加，以及在外周血淋巴細胞中降低了IL-4和IL-10的水平。結果表明，這些患者PLI后細胞因子平衡向Th2活性轉移，免疫細胞發生良好變化。RIF患者進行PLI可能引起TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平以及NK細胞活性的顯著變化，這可提高懷孕成功率[17]。

4.CD30：活化型Th2表型可以分泌CD30，這是一種糖蛋白受體，是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，其功能是調節Th1/Th2平衡。蛋白水解CD30胞外結構域的分裂產生可溶性的CD30(sCD30)。sCD30是Th2免疫反應的血清指數，在孕婦血清中顯著增加。Gharesi-Fard等[18]報道sCD30濃度在LIT后顯著增加，盡管這種增加與妊娠結局無關。因此，母親血清中sCD30濃度可能不是評價LIT結果的良好標志，因為母親的全身循環不一定反映母體胎兒界面的環境。

5.Treg細胞：不明原因復發性流產患者外周血淋巴細胞的CD4+CD25+Treg細胞水平低于未懷孕的健康婦女，這意味著這些細胞可能增加對孕婦對孕母抗原的免疫耐受，從而保護妊娠。據觀察，使用父系單核細胞對不明原因復發性流產患者進行免疫治療后，Th17和Treg細胞水平分別降低和增加[19]。Treg細胞通過抗炎細胞因子的分泌，如IL-10和TGF，來發揮它們的功能。

三、用于反復種植失敗的患者

為了保證RIF患者的胚胎順利植入，近些年采取了各種治療措施，如給予粒細胞集落刺激因子(G-CSF)[20]、靜脈注射免疫球蛋白和潑尼松[21]和他克莫司[22]。2006年，Yoshioka等[23]采用了一種新的方法，應用PBMCs來改善RIF患者的種植情況。PBMCs由任何具有圓形細胞核的外周血細胞組成，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)、單核細胞和一小部分樹突細胞。考慮到淋巴細胞占PBMCs的絕大部分，使用PBMCs進行治療相當于LIT。在該研究中，采卵當天收集PBMCs，在HCG的存在下培養48 h。然后，將從患者身上新獲得的PBMCs與培養的PBMCs混合，注射入患者宮腔。該研究報告在PBMC治療組的臨床妊娠、植入和活產率高于未治療組。考慮到促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)在促進子宮內膜決定和母體-胎兒免疫調節中的重要作用，建議宮內給予CRH治療的自體PBMC可以提高RIF患者的臨床妊娠率[23]。2016年的研究也表明，與未處理的RIF組相比，新鮮胚胎移植前3 d宮內注射培養的自體PBMCs可以顯著增加RIF患者的植入率和臨床妊娠率(21.5%，44.4%比8.6%，14.81%)[24]。據報道，PBMCs治療患者的植入率和臨床妊娠率分別比RIF對照組高出25%和12%[25]。Li等[26]對294例進行冷凍/解凍胚胎移植周期的RIF患者進行了為期1 d的培養，并與339例RIF患者進行對照。他們在胚胎移植前1 d給予培養細胞，觀察到1～3次移植失敗的患者不能從治療中獲益，但4次或4次以上移植失敗的患者的植入率、臨床妊娠率和活產率顯著增加。而且該方法對裂解期胚胎移植的RIF患者和較薄的子宮內膜厚度的患者都有效。

四、LIT中HLA的作用

通過對父系HLA異型和血型抗原的母體抗體的產生證明，通常存在于胎兒的父系抗原可以刺激母體免疫系統[27]，Moffett等[28]提出了可能的潛在機制來解釋為什么母體的同種異體反應T細胞不會攻擊胎兒滋養層。當絨毛合胞體滋養層不表達HLA-I類或II類分子時，T細胞不能與主胎盤屏障結合。此外，多絨毛滋養細胞(EVT)只表達HLA-I類而不表達II類，因此不能作為APC啟動對母體CD4+T細胞的直接等位基因識別。即使表達的HLA I類分子也不常見，包括HLA-C、HLA-G和HLA-E。然而，誘導耐受性的關鍵分子是HLA-G，一個具有獨特特征的單晶分子。這種分子可以形成一個同質二聚體，并與高親和力的蛻膜APC (LILRB1)表達的抑制受體結合。人類白細胞抗原(HLA)分子是免疫系統中最多態性的分子，在激活外來抗原的同種免疫應答中起著重要作用。經典的HLA II類(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP)和I類(HLA-A、HLA-B)基因在滋養細胞中不表達，因此這些類中沒有母體T細胞介導的細胞毒性反應。然而，細胞表達HLA-G，一種非經典的I類基因，直接或通過HLA-E介導的方式可以使滋養細胞不受NK細胞的識別。考慮到HLA-G僅表達于胎盤組織的母體胎兒界面，它被認為是母親對胎兒免疫耐受的主要因素。已經證明，當父母共享一些相似的HLA抗原時，同種異體免疫反應不會正常發生，從而引發流產過程[29]。

五、LIT可能的副作用

盡管大多數研究聲稱LIT沒有對母親和嬰兒產生副作用，但其安全性并沒有完全的研究。有關LIT最常見的產婦并發癥是病毒感染(肝炎和巨細胞病毒)、流感樣癥狀和發燒(輸血反應)。胎兒(早產、宮內生長受限、胎兒死亡、發育不良)和新生兒(新生兒血小板減少和先天性畸形)比較，其比率有統計學差異，治療組為3%，安慰劑組為4%[30]。為了保證LIT的安全性，Motak等[17]通過對患者的長期監測發現，LIT對治療女性或新生兒的免疫系統沒有任何負面影響。當然，為了保證LIT的安全性，還需要進行大樣本量的長期跟蹤研究。

六、總結

反復種植失敗是現代生殖醫學研究的難點和熱點問題，雖然RIF的病因及主要機制尚未完全闡明，但近年的文獻支持LIT對RIF的效果。最近的研究證明，通過增強APCA、PIBF、Ab2和MLR-BF的表達，以及降低細胞因子的Th1/Th2比率和改變細胞因子的產生，LIT會導致母體免疫系統發生變化，從而可能維持妊娠，但需要進一步研究上述因素在母體胎兒界面的作用及其保護妊娠的機制。考慮到在LIT的RIF和RPL患者中獲得的具有爭議性的結果，有必要確定合適的納入和排除標準，以便在此類治療中招募患者。此外，還需要一份標準的協議，明確說明淋巴細胞的制備方式、淋巴細胞的免疫劑量、應用時間以及給藥途徑。