miR-21通過負調節CYLD表達促進宮頸癌增殖

蘇俊玲 烏云 楊文靜 張燕

宮頸癌(cervical cancer, CC)是全球主要影響女性生殖健康的惡性腫瘤之一，在發展中國家，CC病理檢測占世界女性癌癥死亡病例的60%以上[1-2]。臨床研究發現，病毒感染、遺傳變異、營養不良和免疫功能紊亂等是CC發生發展的重要驅動因子，其中，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是浸潤性CC的重要發病誘因，特別是HPV16和HPV18[3-4]。流行病學研究表明，99.4%的CC患者感染該HPVs病毒[5]。然而，目前基于HPV的CC的診斷及各種治療結果并不能獲得良好的效果，因此進一步揭示CC的發生發展及治療迫在眉睫[6]。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一類長度約為19至24個核苷酸的單鏈和非編碼小RNA分子，其通過形成不完全堿基配對靶信使RNA進行降解或翻譯抑制的基因表達的轉錄后調節因子，已被證明參與多種細胞生長調控和生理病理功能，并且可作為生物標記物(biomakers)用于診斷疾病發生和監測疾病發展[7]。研究顯示，miR-21高表達于CC，且通過調控TIMP3、PTEN/AKT通路、腫瘤壞死因子-alfa(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等參與調控CC細胞增殖、凋亡和遷移[8-9]。miR-21更具有改善耐藥性和調控細胞自噬等多種作用，因此在CC治療與診斷應用方面前景廣闊[10-11]。

Cylindromatosis(CYLD)是一種腫瘤抑制基因，在稱為圓柱狀瘤病的良性皮膚腫瘤綜合征中發生突變，其表達產物為去泛素化酶，主要通過抑制NF-κB信號傳導來調節細胞增殖、細胞存活和炎癥反應[11]。CYLD作為腫瘤抑制分子參與調控細胞周期、下調促癌基因(Proto-oncogene)BCl-3表達，并且在肺癌細胞中的表達受到miR-21調控[12]。然而，miR-182-5p作為CYLD的又一調控分子，其低表達于CC[13-14]。CYLD是否參與CC的發生發展及其作用尚不明確，且CC高表達的miR-21是否通過CYLD參與CC細胞生長尚未可知。

因此，本研究擬檢測CC組織與癌細胞中miR-21表達變化和CYLD蛋白表達，并通過干擾miR-21表達，觀察miR-21對CC細胞增殖、細胞周期相關及CYLD蛋白的影響。

資料與方法

一、資料

選取2016年01月至2018年06月進入內蒙古自治區人民醫院救治的56例CC患者和同期健康志愿者67例，收集外周血并分離血漿后與CC患者腫瘤病變組織和癌旁組織共同凍存于-80 ℃備用，檢測HPV16、HPV18和miR-21含量等。本實驗研究經本院倫理委員會審核批準，所有患者、志愿者均對本研究知情并簽署知情同意書。

人宮頸上皮永生化細胞H8和人CC細胞系：腺癌樣SiHa、HeLa (上皮樣宮頸癌epithelioid cervical carcinoma)和Caski (表皮樣囊腫宮頸, epidermoid cervical carcinoma) 以及MS751、C33A、C4-I、C4-II細胞均購自中國科學院上海細胞庫，Lipo2000、DMEM高糖培養基和cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，胎牛血清購自美國Ausgene公司，TRizol RNA提取試劑盒、RIPA裂解液、Cocktail、磷酸化酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯影液和HRP-山羊抗兔二抗購自武漢塞維爾生物技術有限公司)，SYBGreen qPCR Mix購自北京寶日醫生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自天中國碧云天公司，miR-21、U6 qPCR引物和miR-21抑制劑(miR-486-5p inhibitor)購自廣州銳博生物科技有限公司，CCND1、CCNE、CDK4、CDK6和ACTB qPCR引物購自武漢擎科生物科技有限公司，兔抗人CYLD、b-actin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4和CDK6抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

二、方法

1. HR-HPV檢查：將宮頸外口的分泌物和其他液體清理干凈后，收集分泌物于無菌玻璃管中，采用HPV基因分型檢測試劑盒應用q-PCR方法檢測，即(1)將標本10 000 rpm室溫離心5 min，棄去上清；(2)向上述管子中加入25 μl DNA提取試劑，混勻后，95 ℃加熱10 min；10 000 rpm室溫離心5 min后上清直接用于q-PCR檢測HPV16、HPV18；(3)按照試劑盒要求采用ABI 7500檢測；(4)結果判斷。CT值<35的樣本，即為高危型HPV陽性(高表達)；反之為高危型HPV陰性(低表達)。

2. 細胞培養：所有細胞系42℃復蘇后，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。胰酶消化計數后，以2×104個/孔接種于96孔板中，加入10% FBS的DMEM高糖培養基培養24 h用于干預實驗。

3. 轉染實驗：取miR-21抑制劑(inhibitor)和陰性對照類似物(negative control，NC)干粉，依照說明加入無菌TE溶液溶解至50 mM。取兩支1.5 ml Ep管，各加入100 μl Opti-MEM后分別加入miR-21抑制劑(inhibitor)或NC和5 μl Lipo2000，混勻后室溫孵育3 min，并將兩者混合再室溫孵育20 min，滴加入細胞中繼續培養進行檢測。

4. CCK-8實驗：以終濃度為10 nM的miR-21抑制劑(inhibitor)和NC轉染預先接種至96孔板培養24 h的H8、Hela、C4-I和Caski細胞2 h、24 h、48 h和72 h，加入CCK-8溶液后，37 ℃孵育1 h，采用酶標儀測定 450 nm 的吸光值(OD450)。每組設6個復孔，實驗重復3次。

5.qRT-PCR實驗：以含TRizol RNA 500 μl提取處理后的12孔板細胞，并使用NanoDrop2000對總RNA濃度和純度進行檢測。參照cDNA合成試劑盒操作步驟將500 ng總RNA逆轉錄為cDNA。取10 ng cDNA作模版，25 μl qRT-PCR反應體系，反應程序為95℃ 2 min、95℃ 5s、60℃ 30 s，擴增35個循環，引物序列見表1。以U6為內參，采用2△△Ct法計算miR-21相對表達量，以ACTB為內參計算CCND1、CCNE、CDK4、CDK6 mRNA的相對表達量。

6.Western blot實驗：以含PMSF的RIPA裂解液100 μl裂解12孔板細胞。超聲破碎后，4℃ 14 000 g離心20 min，上清以BCA法檢測蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，95℃干熱變性10 min。20 μg變性蛋白進行10% SDS-PAGE分離后，200 mA 2 h轉移至0.45 μm的PVDF膜，2% BSA TBST溶液封閉30 min，孵育一抗(Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK6、和CYLD稀釋比為1∶750；b-actin稀釋比為1∶1 000)，4℃過夜，TBST漂洗3次，二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯影。

表1 q-PCR引物序列及產物大小Table 1 q-PCR primers sequence and product size

結 果

一、CC病人血漿中HPV16和HPV18、血漿和癌組織miR-21含量檢測

如圖1所示，CC患者血漿中HPV16和HPV18高表達(P<0.05)，其癌組織中miR-21含量顯著高于癌旁組織(P<0.05)，且血漿中miR-21含量顯著高于健康人(P<0.05)。

二、CC病人癌組織與血漿中miR-21與HPV16，HPV18和腫瘤尺寸相關性分析

檢測CC患者血漿HPV16、HPV18水平和腫瘤尺寸并將其與CC組織和血漿miR-21含量作Pearson相關性分析發現，CC患者血漿HPV16、HPV18水平和腫瘤尺寸與血漿和癌組織miR-21含量成顯著正相關性(P<0.001)。 見圖2。

Notes:Compared with controls, *P<0.05圖1 CC病人癌組織與血漿中高表達HPV16，HPV18和miR-21Figure 1 High expression of HPV16, HPV18 and miR-21 in cancer tissues and plasma of CC patients

Notes:***P<0.001圖2 CC病人癌組織與血漿中miR-21與HPV16, HPV18和腫瘤尺寸呈正相關Figure 2 There is a positive correlation between miR-21, HPV16 and HPV18 in tumor tissue and plasma with tumor size in CC patients

三、人CC細胞系miR-21含量檢測

檢測多種CC細胞系的miR-21含量，發現人CC細胞系C4-I、C4-II、Hela、SiHa、C33A、Caski和MS751相比于正常細胞H8均高表達miR-21(P<0.05)，且通過miR-21抑制劑(inhibitor)處理，Hela細胞中miR-21含量顯著降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)。見圖3。

四、miR-21抑制劑(inhibitor)對正常和CC細胞生長影響

通過給予H8、Hela、C4-I、Caski細胞10 nM的miR-21抑制劑(inhibitor)處理2 h、24 h、48 h和72 h后，相比Control處理組，H8細胞miR-21水平均沒有明顯的變化(P>0.05)。而Hela、C4-I、Caski細胞細胞增殖率逐漸降低(P>0.05)，見圖4。

五、下調miR-21對人CC Hela和Caski細胞周期相關蛋白表達的影響

為進一步探究下調miR-21對人CC Hela和Caski細胞增殖影響，檢測細胞周期相關蛋白及其mRNA變化，結果如圖5所示，人CC Hela和Caski細胞miR-21抑制劑組CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白和mRNA(CCND1、CCNE、CDK4)水平明顯高于Control組(P<0.05)，Caski細胞miR-21抑制劑組CDK6蛋白和mRNA顯著降低(P<0.05)，而Hela細胞miR-21抑制劑組的CDK6蛋白和mRNA無明顯變化(P>0.05)。

六、下調miR-21對人CC Hela和Caski細胞CTLD蛋白表達的影響

為了研究miR-21對人CC Hela和Caski細胞周期調控的潛在機制，借助Western Blot檢測Control和miR-21抑制劑轉染處理24 h的人CC Hela和Caski細胞的CYLD蛋白和mRNA變化情況。miR-21抑制劑轉染處理24 h的人CC Hela和Caski細胞中CYLD蛋白和mRNA水平均明顯高于Control組(P<0.05)。見圖6。

Notes:Compared with controls or H8, *P<0.05圖3 人CC細胞系高表達miR-21Figure 3 miR-21 expression levels in human CC cell line

Notes:Compared with 2h, *P<0.05圖4 下調miR-21抑制人CC細胞系增殖Figure 4 Down-regulation of miR-21 inhibits proliferation of human CC cell lines

Notes:Compared with control, *P<0.05圖5 下調miR-21抑制人CC細胞系細胞周期相關蛋白表達Figure 5 Down-regulation of miR-21 inhibits cell-cycle-associated protein expression in human CC cell lines

Notes:Compared with control, *P<0.05圖6 下調miR-21促進人CC細胞系細胞CYLD蛋白表達Figure 6 Down-regulation of miR-21 promotes CYLD protein expression in human CC cell lines

討 論

除了尋找新的CC診斷標志物外，進一步了解CC發生的病理分子機制對于開發更有針對性和有效的治療方法是至關重要的。近些年來，miRNA作為用于鑒別和診斷疾病的新發現，特別是作為慢性病和癌癥的生物標記物(Biomarkers),其在神經科學和癌癥發病機制研究中具有舉足輕重的地位[7]。

CC的發病率在發展中國家幾乎占了全球的80%，嚴重影響人類健康，給政府的衛生系統帶來負擔，迫切需要有效的治療干預措施[2]。然而，由于CC發展的精細分子機制現在仍不清楚，其靶向治療非常有限[1]。本研究CC患者外周血和癌組織高表達miR-21，其和升高的感染因子HPV16、HPV18含量及人體腫瘤體積呈現明顯正相關性，說明miR-21可能成為與HPV16、HPV18相似的HCC診斷指標，可作為又一CC診斷與治療評估指標，且參與CC發生發展，即腫瘤生長。并且發現其作為CC增殖的主要參與miRNA分子，高表達于多種公認的高度遷移、活化及增殖的CC細胞系；其次細胞轉染實驗，顯示下調miR-21抑制多種CC細胞增殖，而不影響正常宮頸上皮細胞，說明其潛在的特異性。同時，文獻報道稱miR-21具有調控多種細胞增殖的潛能，包括影響細胞周期[9-11]。本研究發現，下調CC細胞高表達的miR-21可顯著阻斷CyclinD1-CDK4與CyclinE-CDK2復合物形成，抑制細胞周期，阻斷G1向S期過渡[9]，同時證實此效應與上調腫瘤抑制分子CYLD有關[15]，為miR-21在CC研究及未來的臨床應用提供又一有利支持。然而，由于miR-21在CC存在多態性，且作用于CCSTAT3和TIMP3多種分子[10, 16]，因此仍有待進一步研究。

綜上所述，CC組織與癌細胞高表達的miR-21可能通過抑制CYLD蛋白介導癌細胞周期阻滯促進細胞增殖，同時，其可作為生物標記物參與CC的診斷和治療監測。