轉人4-1BBL-B7-H3基因口腔鱗癌細胞體外誘導抗腫瘤免疫的研究

孫順濤 楊宏宇 羅娟 余術宜 楊輝俊

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌為主。口腔癌的治療方法較多，免疫基因治療是重要的一種手段[1]。機體對腫瘤的免疫主要依靠T細胞免疫。T細胞活化和增殖依賴于雙重信號，一是抗原呈遞細胞呈遞的抗原肽-主要組織相容性復合物組成的第一信號；二是共刺激信號[2-3]。T細胞只有識別這兩個信號才能得到有效增殖，進而發揮其細胞免疫功能。T細胞若缺乏共刺激信號，則進入無反應狀態，甚至發生凋亡[4]。CD28/B7、4-1BB/4-1BBL是激發有效抗腫瘤免疫效應所必需的重要共刺激分子[5-9]。基于此，本實驗通過構建的真核表達載體pEGFP-4-1BBL-B7-H3轉染人口腔鱗癌Tca8113細胞，觀察4-1BBL-B7-H3的體外抗腫瘤免疫作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 口腔鱗癌Tca8113細胞由上海交通大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室提供，Tca8113-4-1BBL、Tca8113-B7-H3腫瘤細胞疫苗由北京大學深圳醫院實驗室前期構建[10-11]。小牛血清、RPMI1640培養基、G418購自美國Gibco公司（批號：1227693），IFN-γELISA試劑盒購自美國R&D公司（批號：20130013）；CCK-8購自日本Dojindo公司（批號：KM671）；兔抗人4-1BBL一抗購自美國CHEMICON公司，CD3單抗購自美國ProMab公司。Trizol、Lipofectamine 2000購自美國Ivitrogen公司。反轉錄試劑盒購自立陶宛Fermantas公司，PCR試劑盒購自北京博大泰克公司，人外周血淋巴細胞分離液購自深圳達科維公司。流式細胞儀表型分析儀、Thermo NanoDrop紫外分光光度計、常規試劑、超速離心機、超低溫冰箱、羅氏定量PCR儀LC480等由北京大學深圳醫院實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體pEGFP-4-1BBL-B7-H3的轉染與鑒定 按Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行，將pEGFP-4-1BBL-B7-H3真核表達載體轉染Tca8113細胞。24h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況和轉染效率。加入 G418（400~600μg/ml）進行 4-1BBL 陽性細胞篩選，1周后用有限稀釋法篩選單克隆。由于人4-1BBL-B7-H3完整的引物難以設計，故分別檢測4-1BBL mRNA和B7-H3 mRNA在腫瘤組織中的表達情況。RT-PCR引物如下。4-1BBL上游引物：5′-CGGGCTCCGTTTCACTTGCG-3′；下游引物：5′-AGTCCGGCTGGGATTTCG-3′，擴增片段長 271 bp。B7-H3 上游引物：5′-CGCACGGCTCTGTCACCATCA-3′；下游引物：5′-TCAGAGGCTGCAGGGCTGTCTTG-3′，擴增片段長591bp。挑選高表達克隆并命名為Tca8113-4-1BBLB7-H3細胞用于后續實驗。用Trizol從轉染pEGFP-4-1BBL-B7-H3的Tca8113細胞中提取總RNA，然后用RT-PCR檢測4-1BBL-B7-H3的表達，應用流式細胞儀分析細胞表型，采用RT-PCR檢測轉染細胞中4-1BBLB7-H3 mRNA的表達。

1.2.2 腫瘤細胞疫苗的制備 收集培養的Tca8113-4-1BBL-B7-H3 細胞，PBS 液洗 2 次，細胞數調至 1×107/ml，以20μg/ml絲裂霉素C處理后，于37℃、5%二氧化碳環境中處理1.5h，PBS液洗3次，以含10%小牛血清的RPMI1640重懸細胞，制成腫瘤細胞疫苗備用。

1.2.3 人外周血淋巴細胞的獲得、培養與純化 采用Ficoll分離的方法獲得健康人的外周血單個核細胞，再經尼龍毛柱分離、純化獲得T淋巴細胞。經流式細胞儀檢測，純化后的T細胞純度可達90%以上。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞毒性T細胞（CTL）殺傷活性將已用絲裂霉素 C（10μg/ml）處理的 Tca8113、Tca8113-4-1BBL、Tca8113-B7-H3、Tca8113-4-1BBL-B7-H3細胞株調整濃度為1×106/ml。分別與純化后的T細胞按1∶2.5混合，分成4組。Ⅰ組：T細胞+滅活Tca8113腫瘤細胞疫苗（TCV-Tca8113）組；Ⅱ組：T細胞+滅活TCV-4-1BBL組；Ⅲ組：T細胞+滅活TCV-B7-H3組；Ⅳ組：T細胞+滅活TCV-4-1BBL-B7-H3組。4組細胞均接種于96孔板培養，100μl/孔，并設復孔。分別于培養24、48、72h棄去培養基，PBS洗2遍，分別各加入100μl無色培養基和10μl CCK-8試劑，在培養箱培育3h，于波長450nm處測定吸光度A值，檢測細胞增殖情況。CTL殺傷活性按以下公式計算：CTL的殺傷活性（%）=[1-（靶細胞對照組A值-實驗組A值）/靶細胞對照組A值]×100%。

1.2.5 細胞因子檢測 活化后T細胞可分泌IFN-γ等細胞因子。分別于培養24、48、和72h，采用ELISA法檢測4組細胞培養上清液中的IFN-γ水平。

1.3 觀察指標 （1）轉染細胞表型分析結果；（2）轉染細胞4-1BBL-B7-H3 mRNA的表達情況；（3）比較4組細胞體外誘導CTL殺傷活性；（4）比較4組細胞培養上清液中IFN-γ水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS12.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染細胞表型分析結果 pEGFP-4-1BBL-B7-H3質粒載體轉染入Tca8113細胞中，采用綠熒光標記和流式細胞儀分析細胞表型，結果顯示轉染的細胞能穩定高表達4-1BBL，見圖1。

2.2 轉染細胞4-1BBL-B7-H3 mRNA的表達情況RT-PCR產物電泳結果表明，4-1BBL擴增產物的大小約271bp，B7-H3擴增產物的大小約591 bp，與預期大小一致，見圖2。這表明人4-1BBL-B7-H3質粒載體轉染成功，Tca8113-4-1BBL-B7-H3細胞構建成功。

圖1 轉染細胞表型分析流式細胞圖（a：mock/Tcca8113細胞；b:4-1BBL/Tca8113細胞）

圖2 Tca8113細胞轉染pEGFP-4-1BBL-B7-H3質粒后的PT-PCR產物電泳圖

2.3 4組細胞體外誘導CTL殺傷活性比較 培養24、48、72h，4組細胞體外誘導CTL殺傷活性比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且與其他3組比較，Ⅳ組細胞體外誘導CTL殺傷活性最強（均P＜0.05），見圖3。

圖3 4組細胞體外誘導CTL殺傷活性比較

2.4 4組細胞培養上清液中IFN-γ水平比較 培養24、48、72h，4組細胞培養上清液中IFN-γ水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與其他3組比較，Ⅰ組細胞培養上清液中IFN-γ水平最低（均P＜0.05），見圖4。

圖4 4組細胞培養上清液中IFN-γ水平比較

3 討論

本實驗中，筆者將構建的pEGFP-4-1BB7-H3質粒載體轉染人口腔鱗癌Tca8113細胞，并獲得穩定高表達，經絲裂霉素C處理后，與純化的人外周血中的T淋巴細胞共同培養，結果顯示T細胞增殖、分泌IFN-γ及抗腫瘤免疫作用明顯。4-1BBL-B7-H3作為共刺激分子，能顯著提高腫瘤細胞的免疫原性，協助誘導T細胞活化，激發特異性抗腫瘤免疫作用。

本實驗結果顯示，4-1BBL-B7-H3提供的共刺激信號能促進T細胞分泌IFN-γ。IFN-γ分泌水平也是反映T細胞活化水平的重要指標，IFN-γ可有效地增強腫瘤細胞表面MHCⅠ類和Ⅱ類抗原分子的表達，有增強抗原遞呈和免疫應答的作用；促進T細胞和B細胞的分化，誘導CTL的產生；在促進激活T細胞的殺傷能力方面具有重要作用[12]。另一方面，IFN-γ亦可促進其他免疫細胞（如NK細胞）對腫瘤細胞的非特異性殺傷作用[13]。

T細胞收集純化后，經流式細胞儀檢測純度均達90%以上，其中混有少量B細胞等單核細胞，共同培養后細胞增殖主要是以CD4+Th和CD8+Tc細胞為主。體內外研究表明，腫瘤細胞往往由于缺乏或低表達這些共刺激分子而不能活化T細胞，介導有效的抗腫瘤免疫應答[14-16]。介導共刺激信號的分子有多種，B7-H3-TLT-2共刺激信號主要在T細胞活化的前期起作用，促進T細胞增殖并維持其短期的存活；4-1BB/4-1BBL信號主要在T細胞反應后期維持T細胞的生存及在免疫記憶應答中起重要作用。腫瘤細胞及T細胞表面的一些其它相互作用分子可能對形成第一信號的三聯體有一定的促進作用。

綜上所述，4-1BBL-B7-H3雙基因修飾的腫瘤細胞疫苗可為口腔鱗癌的治療提供高效、特異的免疫活性細胞和具有廣譜抗腫瘤活性的天然免疫細胞，這對完善腫瘤基因免疫治療提供了一條新的途徑。