NOD1基因型與幽門螺桿菌感染相關慢性胃炎的關系分析

周雪峰 季霞

胃癌是我國國民發病率與死亡率均較高的惡性腫瘤之一[1]。胃癌的發病原因與發病機制尚未完全清楚，目前普遍認為幽門螺桿菌（Hp）感染是胃癌致病因素。患者感染Hp后，會經歷慢性胃炎-慢性萎縮性胃炎-慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生（簡稱慢性胃炎伴腸化生）-異型性增生-胃癌這樣一個發展演變過程；慢性胃炎伴腸化生已是不可逆階段，對于這個過程，目前臨床缺乏有效的防治手段。人體免疫系統組成成員中，核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）1蛋白可通過識別外源性病原微生物，介導天然免疫反應，起到抵御Hp感染的作用。研究發現，NOD1基因多態性與Hp感染相關的胃癌發生有關[2]。目前，臨床對于NOD1基因與慢性胃炎伴腸化生的相關性研究報道少見。本研究通過基因測序的方法檢測慢性胃炎患者的NOD1基因型，探討NOD1基因多態性與Hp感染相關的慢性胃炎發生的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2017年6月本院收治的慢性胃炎患者77例，均經胃鏡檢查確診為慢性胃炎，行快速尿素酶試驗和13C呼氣試驗診斷有無Hp感染。排除標準：（1）患者合并有消化性潰瘍；（2）治療前4周內有服用質子泵抑制劑、抗生素、非甾體類藥物；（3）既往有腫瘤性疾病史；（4）有胃大部切除手術史；（5）有心、腦、肺、腎、肝等重要臟器功能不全；（6）妊娠期婦女。患者根據Hp感染情況分為Hp陽性組36例，Hp陰性組41例。Hp陽性組男 14例、女 22例；年齡 16～93（52.29±13.50）歲。Hp陰性組男 19例，女 22例；年齡 32～77（49.94±16.81）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及胃黏膜病理診斷 患者均行胃鏡檢查，并在胃竇大彎、胃竇小彎、胃角、胃體大彎、胃體小彎處留取胃黏膜組織，同時抽取外周血3ml，保存在-80℃冰箱里備用。胃黏膜組織以10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，然后切片行HE染色，由2位中級職稱及以上病理科醫師參照《慢性胃炎及上皮性腫瘤胃黏膜活檢病理診斷共識》[3]作出病理診斷。其中慢性胃炎伴腸化生患者31例，無腸化生患者46例。

1.2.2 NOD1基因PCR擴增與測序 使用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，試劑盒編號：DP332）抽取樣本DNA，具體操作步驟參見說明書。采用PCR法進行NOD1單核苷酸擴增，NOD1引物序列如下：上游引物5′-TCCAAGTTCGTGCTGTGCTA-3′，下游引物 5′-CAGGTCCAAGTCCGAGTGC-3′。產物大小約500bp。然后，5μl PCR擴增產物加入至1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，110V，35 min，應用凝膠成像系統進行觀察。待電泳條帶出現，進行酶純化，具體如下：取電泳產物加入到 2μl反應體系中（EXOI 0.5μl，CIP 0.1μl，蒸餾水 1.4μl），反應條件：37°C 50min，95°C 5min。接著進行測序反應（試劑為美國ABI公司生產的Bigdye Terminator V3.1），每組樣本準備2個0.2ml規格的 PCR反應管，分別標記上、下游（雙向測序），每管分別加入1μl Bigdye Terminator、1μl水、2μl酶純化產物，及上游或下游引物（3.2μmon/L）1μl，共 5μl。反應條件為 95°C 4min，95°C 15s，50°C 20s，60°C 2min，25 個循環。測序反應結束后，打開管蓋，每管先加入2μl EDTA，靜置5min，隨后加入15μl無水乙醇，13400 rpm離心30min，離心結束倒去液體，甩干，加入50μl冰凍的75%乙醇溶液，13400 rpm離心15min，離心結束倒去液體，甩干，為避免剩余酒精對后續實驗的影響，進行烘干。向完成測序反應的產物中加入2μl 125mmol的EDTA，靜置5min；加入15μl無水乙醇，漩渦混勻；13000rpm離心30min；倒置離心15s，加入50μl 70%乙醇溶液，漩渦混勻；13000rpm離心15min；倒置離心15s，置于95°C金屬浴上；加入10μl Hi-Di后進行變性試驗。變性試驗結束后，上測序儀（美國應用生物系統公司，ABI3730）進行基因測序。基因序列使用3730 Data Collection V3.0 Sequence analysis5.3.1軟件進行分析。

1.3 觀察指標 （1）觀察NOD1基因擴增產物及基因型檢測結果；（2）比較兩組患者NOD1基因型分布情況；（3）比較Hp陽性組、Hp陰性組中不同NOD1基因型患者胃黏膜腸化生情況。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件；計量資料以 表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NOD1基因擴增產物及基因型檢測結果 NOD1基因PCR擴增產物電泳結果見圖1。通過對電泳圖的分析顯示PCR擴增有效，且條帶單一。77例標本均PCR擴增成功且測序成功；同時測序圖譜中各個標本的堿基峰單一清晰，測序結果理想。NOD1基因包括GG、GA、AA 3種基因型，共檢出GG型33例，GA型37例，AA型7例。

圖1 部分標本（編號42～65）NOD1基因PCR擴增產物電泳結果

2.2 兩組患者NOD1基因型分布情況比較見表1。

表1 兩組患者NOD1基因型分布情況比較[例（%）]

由表1可見，兩組患者NOD1基因型分布情況比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與Hp陰性組比較，Hp陽性組患者NOD1基因GG型比例降低，GA型比例升高，AA型差異不大。

2.3 Hp陽性組、Hp陰性組中不同NOD 1基因型患者胃黏膜腸化生情況比較見表2。

表2 Hp陽性組、Hp陰性組中不同NOD1基因型患者胃黏膜腸化生情況比較[例（%）]

由表2可見，Hp陽性組、Hp陰性組中不同NOD1基因型患者胃黏膜腸化生情況比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

固有免疫系統是人體的重要防御機制，受體識別各種抗原，啟動免疫反應，繼而激活特異性免疫應答[4]。NOD受體家族（NLRs）存在于細胞質中，屬于模式識別受體。NLRs是一類在遺傳上高度保守的蛋白質家族，其廣泛分布于人體的多種細胞[5]。NOD1是NLRs的重要成員之一，其在機體的各種組織細胞中表達，可識別部分革蘭陽性球菌和所有革蘭陰性桿菌中的γ-D-谷氨酰基-二氨基庚二酸，促進多種炎癥因子表達，如TNF、IL等，從而使炎性細胞向病原作趨化運動并清除病原[6-7]。研究發現，Hp感染模型會通過Ⅳ型免疫系統激活上皮細胞中NOD1介導的NF-κB信號通路[8]。另外，研究還發現，Hp通過NOD1誘導Ⅰ型IFN的生成，從而介導了Hp感染相關疾病的發生、發展[9]。NOD1基因位于人染色體7p14-15，其與上消化道疾病發生有關[10-12]。

本研究結果顯示，兩組患者NOD1基因型分布情況比較差異有統計學意義。與Hp陰性組比較，Hp陽性組患者NOD1基因GG型比例降低，GA型比例升高，AA型比較差異不大。Hp陽性組、Hp陰性組中不同NOD1基因型患者胃黏膜腸化生情況比較差異均無統計學意義。這提示，NOD1基因多態性影響人體對Hp的易感性，但與HP感染相關的慢性胃炎患者胃黏膜腸化生的發生、發展無明顯關系，這可能是因為胃黏膜腸化生過程受多因素影響，而非單因素影響。