過氧化氫誘導人肝癌細胞BEL7402產生氧化應激細胞模型的建立

文麗梅，盧帥，呂國棟，李亞芬，鄭璇，田春艷，趙軍，王建華

氧化應激(oxidative stress，OS)，最早是在1985年由Park等[1]提出。正常情況下，機體內氧化與抗氧化系統處于動態平衡狀態，但是在遭受到有害刺激時，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量生成，超過了機體抗氧化系統的清除能力，致使ROS的產生與清除失衡，就會導致氧化應激[2]。近年來，有研究發現阿爾茨海默病[3]、糖尿病、高血壓或其他心血管疾病[4-5]、癌癥等許多疾病都與氧化應激有關。過氧化氫(H2O2)是一種很強的氧化劑，可誘導機體產生大量的ROS，導致機體的氧化應激反應，造成機體氧化損傷。ROS的大量積聚廣泛攻擊體內生物大分子，被攻擊的蛋白質、脂類可經降解，再重新合成，但核酸分子損傷后一般不被降解而直接修復，未被修復的損傷DNA片段可積累下來，造成進一步更大的損害。有報道稱幾乎所有氧化應激狀態都有H2O2產生，它還能夠穿透細胞膜，而且易于取得，性質穩定[6]。因此，H2O2已成為建立體外氧化損傷模型的重要工具[7-8]。本研究以H2O2為誘導劑，以人肝癌細胞BEL7402為基礎，通過測定細胞存活率、ROS含量、DNA損傷狀況、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，探索得到最佳H2O2濃度及干預時間，從而構建體外氧化應激模型，為進一步研究抗肝癌藥物的氧化應激機制奠定了基礎。

1 材料與方法

本研究起止時間為2017年3月至11月。

1.1試劑與材料BEL7402購自協和醫科大學；噻唑藍(MTT，美國Biosharp公司，生產批號2016/12)；碘化丙啶(生物染色劑級，純度≥95%，生產批號P-4170)和瓊脂糖(生物技術級，純度≥98%，生產批號9012-36-6)均購自美國Sigma公司；胰蛋白酶(生產批號1665788)、胎牛血清(FBS，生產批號1205331)和RPMI 1640培養基(生產批號8116524)均購自美國Gibco公司；青鏈霉素(雙抗，美國Hyclone公司，生產批號J160035)；二甲基亞砜(DMSO，生產批號#2035C358)、低熔點瓊脂糖(生物技術級，生產批號0815)和乙二胺四乙酸(EDTA，分析純，生產批號6381-92-6)均購自美國Amresco公司；H2O2(醫用級別，陜西欣通化工公司，生產批號20160526)；PBS緩沖液(北京索萊寶公司，生產批號20160829)；丙二醛試劑盒(MDA，生產批號20160707)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD，生產批號20160707)和谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-Px，生產批號20160708)均購自南京建成生物工程研究所；測定與分析用水均為超純水。

1.2儀器SW-CJ-IFD型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(日本SANYO公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)；IX73熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；SORVALL LEGEND RT+冷凍離心機(美國Thermo公司)；37 ℃恒溫CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；Varioskan Flash全波長掃描式多功能酶標儀(美國Thermo公司)；Mupid-2plus電泳儀(日本MUPID公司)；PSY-2220數顯恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1BEL7402培養[9]將BEL7402細胞培養于CO2恒溫(37 ℃)飽和濕度的培養箱中，培養液為含有10%胎牛血清，2%青鏈霉素的RPMI1640培養基，每2～3 d換培養液，消化采用0.25%的胰蛋白酶(含0.02%的EDTA)，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2分組及處理 實驗共設4組，分別為健康對照組、10 μmol/L H2O2組、100 μmol/L H2O2組和1 000 μmol/L H2O2組，每組做3個平行副孔。

1.3.3細胞存活率測定 用MTT法檢測細胞存活率[10]，取對數生長期的BEL7402細胞，按105個/mL接種至96孔板，培養24 h后，棄去上清，健康對照組加200 μL培養基，H2O2處理組分別加等體積的終濃度為10、100和1 000 μmol/L的H2O2的培養基溶液，每組做3個平行副孔。分別繼續培養0、2、4、6、8、10、12和24 h，每孔再加入0.01 mL 5 mg/mL的MTT，繼續孵育4 h后，吸去上清液，每孔加0.2 mL的DMSO，震蕩5 min，用酶標儀對各孔在波長570 nm處吸光度值進行檢測。

1.3.4細胞DNA損傷測定[11]采用單細胞凝膠電泳技術來檢測細胞DNA的損傷情況(彗星實驗)，取對數生長期的BEL7402細胞，按105個/mL接種于96孔板上，設為4組，每組3個平行副孔。培養24 h，吸去培養液，采用上述加藥物方法處理4 h，吸去培養液，用4℃預冷的PBS洗1次，加入0.25 %胰蛋白酶進行消化后，離心機1 000 r/min離心5 min，收集細胞，再用PBS重懸。將載玻片浸入0.6 %的正常熔點瓊脂糖中，對載玻片進行干烤過夜(65 ℃)，待用。取0.1 mL單細胞懸浮液，離心，沉淀用100 μL 0.75 %的低密度瓊脂糖混勻，鋪于第一層膠上，蓋上蓋玻片，4 ℃放置5 min，使其凝固后移去蓋玻片。將膠板浸入4 ℃新配置的細胞裂解液(0.1 mol/L Na2EDTA、2.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷 (trihydroxymethyl aminomethane，Tris)，NaOH調pH至10.0，臨用前根據用量按總體積加1 % Triton-X-100，10 % DMSO混勻)中1.5 h，溶解細胞膜和核膜。取出載玻片，用PBS輕柔沖洗2次，以去掉載玻片表面高濃度的鹽，然后將膠板浸入4 ℃水平電泳槽(堿性電泳緩沖液為：0.001 mol/L Na2EDTA、0.3 mol/L NaOH，pH 13.0，現配現用)中，緩沖液約覆過膠面0.25 cm。堿解旋20 min，電泳(20 V，200 mA)20 min。電泳完畢后，濾紙吸干載玻片電泳緩沖液，再用Tris-HCl(pH 7.5)中和15 min。最后用50 μg/mL的PI染液避光染色15 min，蒸餾水脫色5 min，用熒光顯微鏡進行觀察[12]并拍照。用CASP軟件對圖片中采用等距隨機抽樣法選取的20個細胞進行尾距(olive tail moment，OTM)的測定(尾部DNA的百分比與頭、尾中心間距的乘積)。

1.3.5活性氧含量測定[13]雙氫羅丹明123(DHR123)作為一種熒光探針本身無熒光，但能夠進入大多數細胞，被氧化成的熒光產物羅丹明123大量聚集在線粒體膜上，即被廣泛用來檢測活性氧自由基含量的變化。實驗分為4組，即正常組、10、100、1 000 μmol/L H2O2藥物處理組。先向長滿細胞的孔板中加入終濃度為2×10-6mol/L的DHR123，放置在37 ℃恒溫培養箱中孵育，采用全波長掃描式多功能酶標儀讀數，動態讀取熒光值120 min，每10分鐘1次。

1.3.6MDA、SOD、GSH-Px測定 采用上述加藥物方法處理BEL7402細胞4 h后，用無菌PBS洗3遍，用0.25 %的胰蛋白酶(含0.02 %的EDTA)消化，制成細胞懸浮液，4 000 r/min，離心5 min，收集細胞，用1 mLPBS洗1遍，然后加細胞裂解液(150 mmol/L NaCl、150 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1 % Triton X-100，pH 8.0)裂解細胞，低溫(4 ℃)離心1 h，收集上清液，參照南京建成生物工程研究所提供的相應試劑盒說明書，檢測細胞內MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

2 結果

2.1不同濃度H2O2處理對BEL7402存活率影響不同濃度的H2O2處理BEL7402細胞0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h后，對其存活率進行檢測，統計結果(χ2=52.94，P<0.01)如圖1所示：高濃度的H2O2(1 000 μmol/L)抑制BEL7402細胞存活率，而低濃度的H2O2(10和100 μmol/L)則是先抑制增長后刺激增長。100 μmol/L H2O2處理BEL7402細胞4 h后，其存活率為(43.44±5.74)%，與10 μmol/L處理組(92.77±5.51)%相比，細胞存活率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 不同濃度H2O2對BEL7402細胞活性的影響(n=3)

2.2不同濃度H2O2處理對BEL7402細胞ROS含量的影響采用不同濃度的H2O2處理BEL7402 細胞120 min內活性氧含量如圖2所示：100 μmol/L H2O2組BEL7402細胞體內的活性氧含量在40 min時達到峰值，之后呈下降趨勢；而10 μmol/L H2O2組BEL7402體內的活性氧含量始終處于較低水平；1 000 μmol/L H2O2組BEL7402體內的活性氧含量在40 min之后低于正常組，這可能與BEL7402細胞不能耐受1 000 μmol/L H2O2，細胞存活率下降，從而導致活性氧含量急劇下降，以致低于健康對照組。

圖2 不同濃度H2O2對BEL7402細胞內ROS含量的影響(n=3)

2.3不同濃度H2O2處理對BEL7402細胞DNA損傷影響不同濃度H2O2處理BEL7402細胞4 h后單細胞凝膠電泳實驗見圖3。各組Olive尾距(OTM值)統計結果(F=16.25，P<0.01)見表1。與健康對照組比較，10 μmol/L H2O2組OTM值差異無統計學意義(P>0.05)，100 μmol/L H2O2組OTM值升高(P<0.05)，1 000 μmol/L H2O2組OTM值升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖3 彗星實驗檢測H2O2誘導的BEL7402細胞DNA損傷：A為健康對照組；B為10 μmol/L H2O2組；C為100 μmol/L H2O2組；D為1 000 μmol/L H2O2組

組別細胞數尾距/(μm,x±s)健康對照組200.12±0.2210 μmol/L H2O2組200.23±0.15100 μmol/L H2O2組207.04±2.84a1 000 μmol/L H2O2組2016.57±5.21b

注：與健康對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

2.4不同濃度H2O2處理對BEL7402細胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性影響濃度不同的H2O2作用于BEL7402細胞4 h后MDA含量(F=441.92，P<0.01)、SOD活性(F=713.99，P<0.01)及GSH-Px活性(F=46.578，P<0.01)結果如表2所示：與健康對照組相比，10 μmol/L的H2O2作用于細胞，MDA含量升高(P<0.05)；100 μmol/L H2O2處理細胞后，MDA含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性下降(P<0.05或P<0.01)；1 000 μmol/L H2O2處理細胞后，MDA含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性下降，差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 不同濃度H2O2處理(平行副孔數=5)對BEL7402

注：與健康對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

3 討論

在人體中，肝臟是進行代謝的主要臟器，也是外源性毒物和藥物等代謝的主要器官，因此也是體內發生氧化應激的中心部位。肝癌是惡性腫瘤中發病率較高的一種，嚴重威脅著人民的生命健康。目前有研究表明[14]，一方面氧化應激或脂質過氧化造成的DNA氧化損傷是腫瘤發生的重要致病機理，另一方面腫瘤細胞對氧化應激的敏感性高于正常細胞。1974年，從臨床肝癌手術標本中成功提取培養的BEL7402細胞株，與臨床肝癌細胞相似。Roshan[15]指出吉馬酮可以濃度依賴性的提高活性氧濃度并促進細胞凋亡。MDA是脂質過氧化產物，通過MDA含量反映脂質過氧化程度，SOD、GSH是機體主要抗氧化酶，二者水平是反映機體抗氧化能力的重要指標[16]。因此本研究對于研究氧化應激類的肝病，如肝癌、脂肪肝、各種因素導致的肝炎等的發病機理、藥物的臨床應用都有重要的意義。

H2O2易得，性質穩定，易透過細胞膜，生成活性氧自由基，用H2O2誘導的氧化應激模型，應用最為廣泛[17]。同時，也是細胞內最豐富的活性氧簇ROS之一，參與調節新陳代謝、凋亡和生長因子等相關的信號通路。盡管其本身會迅速與信號分子反應而失活，但其造成級聯反應能導致氧化應激持續存在，使其成為氧化應激研究的重要工具藥。但是，H2O2的最終濃度及處理時間所造成的腫瘤細胞BEL7402的氧化應激狀態仍不明確，其具體機制仍有待闡明，因此，探討H2O2誘導的氧化應激模型中，動態監測BEL7402細胞系的應激反應必將對研究氧化應激相關疾病的發生機制和預防提供新的思路。

不同濃度的H2O2對細胞存在雙向性作用：在H2O2濃度作用不同時間后發現高濃度H2O2(1 000 μmol/L)抑制BEL7402細胞存活率，而低濃度的H2O2(10和100 μmol/L)則是先抑制增長后刺激增長。因此可以說明在氧化應激狀態下，由于細胞對H2O2的削減作用不同，可能影響實驗結果。肝癌細胞在氧化應激環境中存在雙向反應。另外，我們采用4 h的藥物處理時間，濃度為100 μmol/L的H2O2作用于BEL7402細胞，彗星實驗效果明顯，其細胞尾部明顯增長，而且SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，變化明顯。推測4 h為最佳作用時間，而100 μmol/L為最佳H2O2濃度。除此之外，100 μmol/L H2O2可使BEL7402細胞內的活性氧含量在40 min時升到峰值，且在藥物處理的120 min內，其ROS含量始終高于正常組的ROS含量，說明其既可升高BEL7402細胞內的ROS含量，且使其保持存活狀態，模擬了體內氧化應激反應。

綜上所述，濃度為100 μmol/L的H2O2作用BEL7402細胞4 h，可成功構建以H2O2為氧化應激誘導劑的BEL7402細胞體外氧化應激模型。ROS引發的氧化應激是多種肝病的共同病理生理基礎。人肝癌細胞株BEL7402與肝細胞具有相似的生物學活性，因此BEL7402細胞氧化應激模型的建立為揭示氧化應激機制以及研究和篩選可能通過氧化應激機制發揮抗肝病作用的新藥研發奠定基礎。