HPLC測定毛蕊花糖苷原料藥含量的不確定度評估△

毛樂靜，霍仕霞，孔征，譚雪，閆明

(1.新疆醫科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆 烏魯木齊 830049)

毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類化合物，具有抗衰老、增強免疫力、抗老年癡呆等作用[1-2]。筆者課題組已從新疆特色資源管花肉蓯蓉中提取分離純化制備得到了高純度的毛蕊花糖苷原料藥，建立可靠的質控方法是保證該原料藥質量的關鍵，筆者依據2015年版《中華人民共和國藥典》一部肉蓯蓉含量測定項下方法，進行了毛蕊花糖苷原料的含量測定，在測定的過程中，發現該方法存在很多不確定的因素，在稱量、溶液稀釋、測定及方法學考察等每一個環節都存在不確定的因素，這些不確定的因素造成最終的測量值都會存在不能肯定的部分，稱為不確定度[3]。不確定度與隨機性、模糊性、不完全性有關。測量的不確定度在分析化學領域是一個非常重要的概念，是評價實驗結果可信賴程度的指標。為了增加實驗結果的可比性，需要將其更加廣泛地應用到分析實驗中[4]。作者針對毛蕊花糖苷原料藥含量測定每個環節存在的不確定因素進行分析，并對每個環節所產生的不確定度加以歸納，從中分析各個環節的不確定度對最終測定結果的影響，評估該含量測定方法的可靠可信度，使含量測定結果更有意義，為毛蕊花糖苷原料藥質量控制和客觀評價提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀：LC-20 AB泵，SPD-M 20 A二極管陣列檢測器，CBM-20 A系統控制器，CTO-20 A柱溫箱，SIL-20 A自動進樣器，DGU-20 A3在線脫氣裝置；SQP-224-1CN天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；SK 8210 HP型超聲清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

1.2 材料

毛蕊花糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201208，純度：92.5%)；甲醇：HPLC級，Sigma-Aldrich公司；水為超純水；甲酸(天津市富宇精細化工有限公司，批號：20140818)。

毛蕊花糖苷原料藥(新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，批號：20130228、20130311、20130323、20130405、20130417、20130426、20130511、20130520、20130526、20130611)。

2 方法

2.1 色譜條件及系統適用性

BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；檢測波長：330 nm[5]；流動相：甲醇-0.2%甲酸水溶液(35∶65)[6]；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；在上述條件下進樣分析，毛蕊花糖苷與其他組分實現基線分離，分離度大于1.5，理論板數大于3000。

2.2 對照品溶液的制備

取毛蕊花糖苷對照品20 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動相[甲醇-0.2%甲酸溶液(35∶65)]稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.8 mg毛蕊花糖苷的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加流動相溶解定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取毛蕊花糖苷原料藥20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相溶解稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL至10 mL量瓶中，加流動相溶解定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取上述對照品溶液適量，分別制成毛蕊花糖苷質量濃度為5、10、20、40、60、80、120 μg·mL-1的系列對照品溶液，按2.1項下方法測定，分別以對照品溶液濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線并進行回歸處理，得毛蕊花糖苷標準曲線回歸方程：Y=207 67X-1 329.5，r=0.999 6，線性范圍為5～120 μg·mL-1，結果表明在5～120 μg·mL-1毛蕊花糖苷峰面積與質量濃度具有良好的線性關系。

2.5 精密度考察

取毛蕊花糖苷原料藥供試品(批號：20130228)6份，按供試品項下的方法制備供試品溶液，照含量測定色譜條件下進樣，記錄峰面積。結果RSD為1.3%(n=6)。

2.6 穩定性考察

取同一批毛蕊花糖苷原料藥樣品(批號：20130228)，處理條件分別為室溫和4 ℃冷藏，分別于0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96 h進行含量測定，結果室溫放置條件下RSD為1.2%(n=12)，冷藏條件下RSD為1.4%(n=12)，表明供試品溶液在96 h內穩定性良好。

2.7 檢測限及定量限測定

配制質量濃度適當的毛蕊花糖苷對照品溶液，進樣10 μL，當信噪比S/N為3時，其檢測質量濃度約為0.120 0 μg·mL-1；當信噪比S/N為10時，其定量限為0.375 0 μg·mL-1。

2.8 加樣回收率試驗

取毛蕊花糖苷原料藥同一批樣品(批號：20130228)，配制低、中、高3個水平的溶液，平行3份。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果低、中、高質量濃度的供試品溶液加樣回收率分別為101.1%、98.2%、99.5%(n=3)，平均加樣回收率為99.6%(n=9)，RSD為1.8%。

2.9 樣品含量測定

制備10批樣品，按供試品溶液制備法處理，按2.1色譜條件下測定，利用標準曲線計算含量，得樣品平均質量分數為99.0%。

3 不確定度分析

用GUM法評定測量不確定度的一般流程：分析不確定度來源和建立測量模型→評定標準不確定度→計算合成標準不確定度→確定擴展不確定度→報告測量結果[7]。

3.1 不確定度來源

高效液相色譜法測定分析過程中的不確定度主要來源于幾個方面：稱量過程、稀釋過程、儀器、對照品純度、回收率、標準曲線以及其他因素[8-9]。如圖1所示。

圖1 不確定度來源分析

3.2 數學模型的建立

采用標準曲線對毛蕊花糖苷原料藥進行含量測定，毛蕊花糖苷含量計算公式如下[10]：

(1)

式中：X為樣品中毛蕊花糖苷含量(mg·g-1)；C樣為根據標準曲線求算的樣品質量濃度(mg·L-1)；P對為對照品的純度(%)；V樣為樣品稀釋體積(mL)；W樣為供試品的取樣量(g)；D為對照品溶液的稀釋倍數；R為方法回收率。

3.3 各不確定度的分析和評定

(2)

式中：p對為對照品純度。

3.3.2 稱量引入的不確定度(B類不確定度) 對照品與樣品稱量引入的不確定度[12]：稱量使用SQP-224-1 CN天平(稱量范圍220 g，精度0.1 mg)，稱樣量分別為20 mg。

(3)

(4)

(5)

式中：u1為天平示值的不確定度；u2為天平稱量重復性引入的不確定度；u為天平引入的不確定度；urel(w)為天平稱量引入的相對標準不確定度；m為質量。

吸量管的不確定度：配制對照品溶液需使用1.0、2.0、5.0 mL吸量管，20 ℃時1.0、2.0、5.0 mL A級吸量管的允差分別為±0.008、±0.012、±0.025 mL[14]。配制對照品溶液由吸量管引入的不確定度按公式(7)計算得為3.278×10-3。

溫度的不確定度：容量器皿校準溫度為20 ℃，實驗室溫度為25 ℃，(20±5)℃時水的體積膨脹系數為2.080×10-4。故對照溶液配制過程中由溫度引入的不確定度按公式(8)計算得為6.467×10-5。對照品溶液稀釋過程引入的相對不確定度按公式(9)計算得為3.316×10-3。

(6)

(7)

(8)

(9)

式中：urel(V對)為容量瓶體積引入的不確定度；n為稀釋次數；u10為10 mL容量瓶引入的不確定度；u25為25 mL容量瓶引入的不確定度；urel(Vp)為吸量管引入的不確定度；urel(VT)為溫度對容量瓶影響引入的不確定度；u(T25)為溫度對25 mL容量瓶影響引入的不確定度；u(T10)為溫度對10 mL容量瓶影響引入的不確定度；u對為對照品溶液稀釋引入的不確定度。

3.3.4 樣品稀釋過程引入的不確定度(B類不確定度) 容量瓶體積的不確定度[15]：20 ℃時100 mL容量瓶的容量允差為±0.1 mL。由容量瓶引入的相對不確定度為4.082×10-4。由溫度引入的不確定度為6.004×10-6。由溫度引入的不確定度可忽略不計，樣品稀釋過程引入的相對不確定度為4.082×10-4。

3.3.5 與標準曲線有關的不確定度(A類不確定度) 采用表1數據按公式(10)和公式(11)得出Y=20 767X-1 329.5(Y表示峰面積，X表示質量濃度)，r=0.999 6，則峰面積測量的標準殘差s為11 808.99，n=7[16]。

應用該曲線測量時，重復3次測量樣品處理液，即p=3，測得樣品平均質量分數為99.0%。

表1 毛蕊花糖苷對照品溶液的HPLC峰面積

(10)

sxx=∑(cj-ca)2=24 245.618 62

(11)

(12)

(13)

式中：s為標準曲線的標準殘差，b1為斜率，p為樣品的測定次數，n為標準曲線的濃度點個數，c0為標準曲線計算的樣品濃度，ca為制作標準曲線的算術平均濃度，cj為校正曲線的單點濃度；c為標準溶液濃度均值；sxx為殘差平方和；yi為峰面積；xi為濃度。

由公式(12)和公式(13)計算得到的不確定度和相對不確定度為0.402 9和9.101×10-3。

3.3.6 測量重復性引入的不確定度(A類不確定度)

3.3.6.1 對照品溶液色譜峰面積的相對不確定度 取20 μg·mL-1的對照品溶液，連續進樣6次[17]，記錄峰面積分別為379 605、379 402、379 682、369 503、379 554、379 632。

(14)

(15)

(16)

平均峰面積A為377 896，RSD=1.1%。標準偏差按公式(15)計算得為4041，實驗標準偏差按公式(14)計算得為1649。對照品溶液相對不確定度按公式(16)計算得為4.446×10-3。

3.3.6.2 樣品溶液色譜峰面積的相對不確定度 制備6份供試品溶液，進樣測定，峰面積分別為410 489、413 273、410 655、411 122、413 165、399 500，平均峰面積為409 700，RSD為1.3%。標準偏差為366 835，實驗標準偏差為149 759，按公式(17)計算引入的不確定度為5.124×10-4。

(17)

3.3.7 回收率的不確定度(A類不確定度) 分別求算高、中、低質量濃度的不確定度[18]。高質量濃度的加樣回收率分別為100.0%、99.1%、99.5%，中濃度的加樣回收率分別為97.6%、99.0%、98.0%，低濃度的加樣回收率分別為102.8%、102.2%、98.4%。高、中、低質量濃度的RSD為0.468 0%、0.709 5%、0.235 0%，高質量濃度：標準偏差為0.465 7，實驗標準偏差為0.268 9，引入的不確定度為1.911×10-3。中質量濃度：標準偏差為0.696 6，實驗標準偏差為0.402 2，引入的不確定度為2.897×10-3。低質量濃度：標準偏差為2.376，實驗標準偏差為1.372，引入的不確定度為9.594×10-4。

3.3.8 HPLC引入的相對不確定度(B類不確定度) 島津高效液相色譜儀檢定證書給出定量測量重復性RSD為0.3%(n=6)[19]，按公式(18)計算得相對不確定為1.225×10-3。

(18)

3.3.9 合成相對標準不確定度(U) 將上述不確定度分量依據含量計算公式，對不確定度合成，按公式(19)計算得不確定度為0.046 8，取包含因子k=2，此時對應的置信概率為95%，毛蕊花糖苷原料藥質量分數為99.0%，質量分數的標準不確定度為4.682，其擴展不確定度為9.364。

(19)

3.4 不確定度分量

該方法引入的總體不確定度為0.046 8，各不確定度分量所占比重如表2所示，比重越高，說明該因素引入的不確定度越大，在實驗操作過程中需要嚴格控制。

表2 HPLC測定毛蕊花糖苷原料藥含量的不確定度評價

4 討論

4.1 實驗過程中各不確定的分類

不確定度指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度，也表明測定結果的可信賴程度。不確定度越小，所述結果與被測量的真值愈接近，質量越高，水平越高，其使用價值越高；不確定度越大，測量結果的質量越低，水平越低，其使用價值也越低[20-21]。在ISO指南中將這些不同種類的分量分別劃分為A類評定和B類評定。本文中A類不確定度包括標準曲線的不確定度、測量重復性的不確定度、加樣回收率的不確定度；B類不確定度包括對照品純度的不確定度、稱量引入的不確定度、稀釋過程引入的不確定度、高效液相引入的不確定度。評估不確定度時，我們需要密切注意產生不確定度的所有可能來源，然后集中精力分析最大的不確定度分量。

4.2 降低不確定度的方法

本研究在對毛蕊花糖苷原料藥進行含量測定的過程中，分析評價了從對照品配制到分析測定各個環節的不確定度，并分析了每個環節不確定度所占的比重，其中稱量造成的不確定度比重最大，占到70%，取樣量的大小及所使用的分析天平的精度直接決定了不確定度的大小，分析時盡量在允許范圍內，增大稱樣量，選擇符合要求的容器；第二是含量測定過程中，標準曲線所產生的不確定度，標準溶液的濃度、標準曲線的斜率、測定的峰面積不確定度，對標準曲線有一定的影響[22]；第三對照品和供試品測定過程中，色譜峰峰面積測定[23]、重復性及重現性考察等都會產生不確定度，這就要求分析人員在操作過程中，盡可能減少操作所造成的不確定；此外對照品的純度、稀釋過程、儀器允差[24]也會引入一定的不確定度，如配制溶液用到的移液管、容量瓶、稀釋的倍數、對照品的選擇，這些都是可以人為控制的因素。儀器選擇上，盡量選擇允差較小的設備。本研究的結果分析了毛蕊花糖苷原料藥含量測定過程中存在不確定度，旨在對分析中的不確定度有一個定性和定量的認識，為后期優化毛蕊花糖苷原料藥的質控方法提供科學的依據。