HPLC同時測定生地黃湯顆粒中11種指標性成分的含量△

劉基，李佳，程江雪，2，鄒俊波，2，郭東艷，2*

(1.陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046)

生地黃湯為唐代孫思邈《千金方》中收載方，由生地黃、大黃組成，具有滋陰涼血、化瘀止血的功能，主要用于腎陰虧虛、瘀血阻滯引起的吐、衄血百治不愈及崩漏。生地黃湯顆粒為生地黃湯經提取濃縮后制成的顆粒劑。方中生地黃為主藥，味甘，寒，入心、肝、腎經，具有清熱涼血、養陰生津之功能。《藥性論》曰其“通血脈，破血，通利月水閉絕……搗敷心腹，能消瘀血。”《開寶本草》云生地黃“破惡血……通血脈，主婦人崩中血不止及產后血上薄心悶絕，傷身胎動下血，瘀血，留血，衄血，吐血。”《本草經疏》稱地黃為“補腎家之要藥，益陰血之上品”，是中藥復方用藥頻率較高的藥味之一[1]。生地黃主要含有苷類、糖類及氨基酸類等成分，其中環烯醚萜苷類成分和苯乙醇苷類成分是地黃中的主要成分，同時也是地黃發揮藥效的主要物質基礎。目前已分離出的環烯醚萜苷類化合物中，梓醇含量最高，此外尚含有桃葉珊瑚苷、地黃苷A、地黃苷D等[2-6]。苯乙醇苷類成分主要以毛蕊花糖苷為主[7]。大黃主要含有蒽醌、鞣質等成分[8]，其中蒽醌苷元是大黃活血化瘀主要物質基礎[9]。目前關于生地黃、大黃單味藥的含量測定方法較多[10-13]，但是有關生地黃湯或生地黃大黃配伍的中藥復方中相關指標性成分的含量測定未見報道。本實驗擬采用HPLC法對生地黃湯顆粒中的主要成分進行含量測定方法學考察，以期建立同時測定11種主要指標性成分含量的方法，為生地黃湯顆粒的質量評價與控制提供依據，同時也為中藥復方中含有生地黃大黃藥對的制劑質量評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(G1311C型四元泵、G1329B型進樣器、G4212B型二極管陣列檢測器、Open LAB工作站)；電子天平[萬分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SartoriusMC 電子天平(十萬分之一)。

1.2 試藥

生地黃飲片購買于寶雞漢方國藥飲片有限責任公司，經陜西中醫藥大學高級實驗師王繼濤鑒定為玄參科(Scrophulariaceae)植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的塊根；大黃飲片購于蘭州旭康藥業有限公司，經陜西中醫藥大學高級實驗師王繼濤鑒定為廖科(Polygonaceae)植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖；生地黃湯顆粒實驗室自制(批號分別為20171001、20171201、20180301)。

梓醇(批號：110808-200508)、沒食子酸(批號：110831-200302)、蘆薈大黃素(批號：110795-200806)、大黃酸(批號：110757-200716)、大黃素(批號：110756-201010)、大黃酚(批號：110796-200310)、大黃素甲醚(批號：110758-200611)對照品購于中國食品藥品檢定研究院；桃葉珊瑚苷(批號：1512102)、地黃苷A(批號：16051725)、地黃苷D(批號：150401)、毛蕊花糖苷(批號：150402)對照品，購于成都普菲德生物技術有限公司；水為娃哈哈純凈水；乙腈為fisher色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Accurasil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(C)-0.1%磷酸水(D)梯度洗脫(洗脫程序見表1)，檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。理論塔板數以梓醇計不低于3000。對照品及供試品的色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

注：A.混合對照品；B.供試品；1.梓醇；2.沒食子酸；3.桃葉珊瑚苷；4.地黃苷D；5.地黃苷A；6.毛蕊花糖苷；7.蘆薈大黃素；8.大黃酸；9.大黃素；10.大黃酚；11.大黃素甲醚。圖1 對照品及樣品HPLC圖

2.2 溶液及樣品的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，色譜甲醇溶解，分別制成質量濃度分別為110、55、198、132、220、176、99、99、98、98、99 μg·mL-1的儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密移取梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚各0.1 mL至量瓶中，制成質量濃度分別為10.0、5.0、18、12.0、20.0、16.0、9.0、9.0、8.9、8.9、9.0 μg·mL-1大黃素甲醚的混合對照品溶液。

2.2.3 生地黃湯顆粒 按照處方比例稱取生地黃600 g，大黃20 g，加10倍量20%乙醇浸漬提取36 h，濾過，濾液減壓濃縮、干燥(60 ℃)，粉碎，80%乙醇制粒，即得生地黃湯顆粒劑[14]，批號分別為：20171001、20171201、20180301。

2.2.4 供試品溶液 稱取生地黃湯顆粒約2.0 g，研細，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入色譜甲醇20 mL，精密稱重，超聲30 min，放至室溫，用色譜甲醇補足重量，搖勻并濾過，取續濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 用移液器分別精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液0.063、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mL，置于2 mL量瓶中，色譜甲醇稀釋至刻度，搖勻，得6個系列濃度的混合對照品溶液。在2.1色譜條件下分別進樣10 μL，以各成分的質量濃度X(μg·mL-1)分別對相應峰面積Y進行線性回歸，得相應的回歸方程和相關系數(見表2)，結果表明，在一定質量濃度范圍內，各成分均有良好的線性關系。

表2 11種成分的線性回歸方程及線性范圍 μg·mL-1

2.3.2 精密度試驗 分別精密移取2.2.2項下的混合對照品溶液適量，按照2.1項下色譜條件重復進樣6次，每次進樣10 μL，記錄峰面積。梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積積分值的RSD分別為1.37%、0.98%、1.16%、1.21%、1.05%、0.99%、1.16%、1.15%、1.02%、1.00%、1.03%，均符合要求，表明該儀器的精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取2.2.4項下供試溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.1項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰峰面積積分值的RSD分別為1.64%、1.24%、1.31%、1.00%、1.05%、0.98%、1.20%、1.09%、0.98%、1.06%、1.12%，均符合要求，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取2.2.3項下生地黃湯顆粒6份(批號：20171001)，分別按照2.2.4項下供試品溶液制備方法制備，依照2.1項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積，外標兩點法計算各成分含量及RSD。結果生地黃湯中梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為4.346 3、1.742 0×10-2、0.102 1、1.487 2、0.585 5、0.423 1、0.342 6×10-2、1.113 8×10-2、0.414 8×10-2、0.241 5×10-2、0.050 8×10-2mg·g-1；含量的RSD分別為1.69%、1.34%、2.15%、1.00%、1.21%、1.56%、2.27%、1.74%、1.35%、1.65%、1.16%，表明重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批生地黃湯顆粒6份(批號：20171001)，分別加入適量梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對照品。按照2.2.4項下方法制備供試液，依照2.1項下的色譜條件，分別進樣10 μL，記錄峰面積，外標兩點法計算含量及加樣回收率。結果梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為98.73%、97.09%、96.43%、97.36%、97.87%、96.34%、96.67%、96.17%、97.04%、97.97%、97.11%；RSD分別為0.97%、1.35%、0.72%、1.47%、0.98%、0.64%、1.29%、1.78%、1.41%、0.77%、1.04%。說明該方法準確度良好。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果(n=9)

續表3

2.3.6 樣品含量測定 取3批生地黃湯顆粒，按2.2.4項下方法制成供試品溶液，依2.1項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。按外標兩點法計算樣品中梓醇、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，結果見表4。

3 討論

《中華人民共和國藥典》2015年版(一部)中地黃項下僅對梓醇和毛蕊花糖苷進行測定[15]，而且采用了兩種測定方法，較為繁瑣。地黃中主要含有環烯醚萜苷及苯乙醇苷，而且這兩大類成分也是其主要活性成分，中華人民共和國藥典中僅對梓醇及毛蕊花糖苷進行含量測定，難以全面反映該飲片的質量。因此對主要活性成分進行含量測定方法學考察，確定含量測定方法，對于全面有效控制制劑的質量具有重要的意義。

波長的選擇：在進行含量測定方法學考察時，發現梓醇、桃葉珊瑚苷、地黃苷A、地黃苷D在203 nm處有末端吸收，毛蕊花糖苷最大吸收在334 nm處，大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在252 nm處有強吸收峰[16-18]。經過在不同波長下及轉換波長多次實驗，結果發現，梓醇在252 nm及334 nm響應值均較小，毛蕊花糖苷及大黃各成分在210 nm處有較高響應值。而采用轉化波長進行測定時基線波動較大。綜合考慮各成分在210 nm波長下，均能得到較好的響應值，靈敏度較好，雜質峰干擾較小，同時也避免了更換檢測波長引起的基線漂移，最終確定210 nm作為檢測波長。

表4 生地黃湯顆粒中11種成分含量測定結果(n=3)mg·g-1

流動相的確定：依據待測11種成分的理化性質及色譜行為，實驗過程對不同比例的甲醇-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.1%磷酸溶液進行了考察，結果表明，以甲醇-0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫，系統壓力較高，以乙腈-0.1%磷酸水進行梯度洗脫，檢測波長為210 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1時，樣品中各成分分離度良好，峰形尖銳對稱，色譜圖基線平穩，因此最終確定以乙腈-0.1%磷酸水溶液系統作為流動相，進行梯度洗脫。

本實驗建立了生地黃湯顆粒中11種指標成分梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量測定方法，方法學考察結果表明，該方法的精密度、穩定性、重復性、加樣回收率均符合要求。而且操作簡單、對儀器設備要求不高，重復性好，能夠同時進行11種成分的含量測定，簡化了樣品制備方法，節約分析時間，可用于生地黃湯顆粒的質量控制，同時也為其他含地黃大黃藥對的中藥復方制劑質量控制提供了參考。