止瀉木子中錐絲堿的提取工藝△

鄭光杰，邱娜，劉凡凡，晉敦青，孫博航*

(1.沈陽藥科大學 中藥學院/基于靶點的藥物設計與研究教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110016；2.鄭州市中心醫院 藥學部，河南 鄭州 467000)

止瀉木子為夾竹桃科止瀉木屬止瀉木的干燥種子，其主要產于我國西藏、新疆、青海、廣西等高海拔地區以及印度、尼泊爾等南亞國家與地區[1]。止瀉木子具有較大的藥用價值，民族醫藥中主要用其治療赤巴病、腹瀉、痢疾等疾病[2-3]。近年來研究表明，止瀉木子中的甾體生物堿是其主要生物活性成分[4]，在這些生物堿中錐絲堿的含量較大[1]，且進一步研究發現，錐絲堿具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，在殺滅寄生蟲、抗菌等作用方面也具有較好的藥理活性[4-9]。但是關于止瀉木子活性部位提取工藝和質量控制研究方面尚未見到相關報道，因此本課題以止瀉木子為研究對象，以錐絲堿為指標性成分，采用響應曲面法優化止瀉木子中錐絲堿的提取工藝[10-11]，為進一步研究其質量控制方法、開發利用止瀉木子的藥用經濟價值具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB135-S 型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-S型水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)；UV-1700型紫外分光光度計[島津國際貿易(上海)有限公司]；R-1001N 型旋轉蒸發儀(鄭州長城科工貿有限公司)；LC-NetⅡ/ADC高效液相色譜分析儀(日本分光株式會社)；DZTW調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器廠)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析色譜柱YMC-Pack ODS-A(日本YMC公司)。

1.2 試藥

錐絲堿對照品(自制，HPLC測定含量≥98%)；甲醇(色譜純，山東禹王化工有限公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

干燥的止瀉木子2015年7月購于安國市新輝藥業有限公司，產地新疆，經沈陽藥科大學路金才教授鑒定為止瀉木子，藥材留樣保存于本研究室。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的止瀉木子粉末4.5 g至圓底燒瓶中，按照實驗設計要求進行加熱回流提取，趁熱抽濾得濾液，合并濾液，減壓濃縮，將濃縮液用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，制成供試品溶液，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取錐絲堿對照品4 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即制成質量濃度為0.4 mg·mL-1的錐絲堿對照品溶液。

2.3 色譜條件

流動相95%甲醇(含二乙胺2‰)，檢測波長215 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL·min-1，進樣量10 μL，供試品、對照品HPLC圖見圖1。

2.4 標準曲線的制定

精密配制錐絲堿儲備液(質量濃度為1.01 mg·mL-1)，分別精密量取該儲備液1、2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，搖勻，分別進樣。以色譜峰峰面積(Y)與對照品溶液濃度(X)進行線性回歸分析，得線性回歸方程Y=6 780 324.63X+8 404.85，r=0.999 9。結果表明，錐絲堿在0.101～0.808 mg·mL-1色譜峰峰面積與對照品濃度線性關系良好。

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖1 錐絲堿對照品、供試品液相色譜圖

2.5 單因素試驗

分別選取提取時間、甲醇濃度、料液比作為影響止瀉木子中錐絲堿提取工藝的3個因素，進行單因素試驗，結果表明，提取時間在0.5～2.5 h、甲醇濃度60%～100%、料液比1∶6～1∶14存在極值。

2.6 提取條件的響應面法優化分析

通過響應曲面法對影響錐絲堿提取效果較大的3個因素提取時間、甲醇濃度、料液比進行優化，以錐絲堿含量為響應值，設計了三因素三水平的試驗方案。通過單因素試驗確定了3個因素的取值范圍。

采用Box-Behnken Design(BBD)設計三因素三水平共17組試驗，以錐絲堿的含量(Y)為響應值，經回歸擬合后，各因素與響應值的回歸方程為Y=2.61+0.12A-0.030B+62.5-0.03C-0.043AB+0.020AC-0.022BC-0.19A2+0.076B2-0.034C2。實驗設計及結果見表1～2。

由方差分析可知，該回歸模型P<0.000 1，表明回歸方程模型極其顯著；失擬項P=0.160 0>0.05，表明失擬不顯著，從而說明該模型能夠對止瀉木子中錐絲堿的提取率進行準確的預測和分析。從回歸方程系數顯著性檢驗可知：一項式A、B極其顯著；二項式A2、B2極其顯著；交互項AB具有一定的顯著性，AC和BC不顯著。說明不同的提取工藝對止瀉木子中錐絲堿提取率并非簡單的線性關系。

表1 止瀉木子中錐絲堿提取工藝BBD設計因素

對擬合方程求解，得最優提取參數：甲醇濃度73.14%；提取時間70.63 min；液料比1∶8.63，預測止瀉木子中錐絲堿的質量分數為2.638 72 mg·g-1。考慮到實驗的可操作性，將工藝優化為料液比1∶9，提取時間為70 min，甲醇濃度為75%。

根據所擬合的回歸方程，作相應曲面圖，考察所擬合的響應曲面形狀，分析甲醇濃度、料液比、提取時間對止瀉木子中錐絲堿提取率的影響。其等高線圖和3D響應曲面圖見圖2～4。3組圖直觀地反應了各因素對響應值的相互影響，甲醇濃度和提取時間的相互作用較顯著。等高線的形狀可反應出交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表明因素間交互作用較弱。

表2 止瀉木子中錐絲堿提取工藝BBD設計結果

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖2 提取時間與料液比的等高線圖和3D響應曲面圖

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖3 甲醇濃度和提取時間的等高線圖和3D響應曲面圖

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖4 料液比與甲醇濃度的等高線圖和3D響應曲面圖

2.7 優化工藝的驗證

平行3次驗證試驗，錐絲堿質量分數分別為2.65、2.63、2.67，RSD為0.75%，方程預測結果與實測值之間差距較小，表明建立的數學模型具有較好的預測性。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上通過響應曲面法得到了止瀉木子中錐絲堿的最佳提取工藝條件：甲醇濃度75%；提取時間70 min；料液比1∶9。驗證試驗表明，在該工藝條件下對錐絲堿具有較高的提取率，這為止瀉木子質控標準的建立和進一步開發利用提供了依據。