分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定植物油中11種多環芳烴

張 冰 張 蕊葉 金吳 宇軒志宏 謝 剛王松雪馬海華

(國家糧食局科學研究院1，北京 100037)(河南工業大學信息科學與工程學院2，鄭州 450000)

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指含有兩個或兩個以上稠合苯環的化合物，是一類化學致癌物和環境污染物，因此國內外植物油相關標準中均對PAHs做出嚴格的限量規定。歐盟關于食品中多環芳烴的條例(EU) NO 835/2011[1]中規定了可直接消費或作為食品成分的油脂中苯并(a)芘的最高殘留限量為2 μg/kg，同時要求苯并(a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)熒蒽、四種(PAH4)總量不超過10 μg/kg。GB 2716—2005 《食用植物油衛生標準》[2]也明確規定了植物油中苯并(a)芘含量應小于等于10.0 μg/kg。同時，GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[3]對油脂及其制品中苯并(a)芘做出相同的限量規定。

植物油中主要成分甘油三酯及其脂肪伴隨物嚴重影響著多環芳烴的分析檢測，因此植物油中多環芳烴的提取凈化是檢測植物油中多環芳烴的關鍵。目前主要的提取凈化方法有液液萃取法[4]、固相萃取法[5](SPE)、固相微萃取法[6](SPME)、凝膠滲透色譜法[7](GPC)等。近幾年來，分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers, MIPs)受到越來越多的關注。MIPs是以目標分子為模版，將具有結構互補的功能單體通過共價鍵或非共價方式和模版分子結合，進行聚合反應，再洗脫模版分子得到。MIPs作為固體吸附劑在固相萃取、基質固相分散萃取、固相萃取、攪拌棒吸附萃取和磁萃取等前處理中有著廣泛的應用[8]。分子印跡固相萃取(molecularly imprinted polymer solid-phase extraction, MIP-SPE)通過將分子印跡技術和固相萃取技術相結合，以分子印跡聚合物為固相萃取的吸附劑，克服了傳統固相萃取選擇性差的缺點，對目標組分特異性的吸附結合，在生物、食品、環境等復雜樣品中有很好的應用[9]。胡園等建立分子印跡固相萃取結合超高校液相熒光法測定螺中15種多環芳烴的方法，在5、10、20 μg/kg加標水平下，15種PAHs回收率73.07%～108.06%，相對標準偏差0.6%～9.2%[10]。朱琳等[11]通過高分子印跡固相萃取-氣相串聯質譜法測定動植物油脂中15+1種歐盟優控多環芳烴，16種PAHs回收率37.90%～105.24%，相對標準偏差小于15%。

常用的PAHs檢測方法有氣相串聯質譜法[5]、液相串聯質譜法[12]、高效液相色譜法[7]、熒光光譜法[13]等方法，其中氣相串聯質譜法難以應對高沸點PAHs檢測，對熱穩定性較差的多環芳烴檢測較差。液相質譜聯用儀器昂貴，對人員要求較高。熒光光譜法不適用于多組分PAHs的同時檢測。而高效液相色譜-熒光檢測器法，儀器較為普及，相對其他測定方法有靈敏度高，檢出限低，檢測種類多，分析時間短等優勢，可用于包括高沸點PAHs在內的多種PAHs的同時定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12種食用植物油樣品，葵花籽油、菜籽油、芝麻油、大豆油、玉米油、花生油和橄欖油等，購自當地超市。

二氯甲烷、正己烷、環己烷、乙腈，色譜純； EPA16多環芳烴混標,溶解于乙腈溶劑；SPE固相萃取柱Cleanert PAH MIP；液相色譜柱Athena PAHs HPLC Column, 4.6 × 250 mm, 5 μm。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配備熒光檢測器；12位固相萃取裝置。

1.3 樣品處理

稱取0.5 g植物油樣品至15 mL離心管中，3 mL環己烷溶解，所使用容器事先均經過正己烷清洗排除本底值干擾。分子印跡柱經過10 mL二氯甲烷和5 mL環己烷活化平衡，將3 mL溶解樣品的環己烷加入到固相萃取柱中，用4 mL環己烷淋洗抽干小柱，再用10 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫后的樣品溶液氮吹至近干，1 mL乙腈定容，上機測定。

1.4 儀器條件

梯度洗脫：流動相A：乙腈，流動相B：超純水；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。流動相梯度條件見表1，熒光檢測器熒光條件設置波長見表2。

表1 多環芳烴梯度洗脫條件

表2 多環芳烴熒光條件參數設置

2 結果與討論

2.1 固相萃取前處理條件優化

2.1.1 淋洗體積用量的優化

本實驗選用環己烷[14]作為淋洗溶劑，淋洗的主要目的在于去除甘油三酯及其他油脂伴隨物，避免這些物質影響多環芳烴的分離和檢測。考察了2、4、5、6、8 mL淋洗體積環己烷的淋洗效果。圖1為五種不同體積的環己烷淋洗后洗脫液中干物質質量關系圖。結果顯示，經過不同體積環己烷淋洗后洗脫液干物質的質量分別為0.038、0.021、0.015、0.012、0.010 g，說明樣品中甘油三酯及其他油脂伴隨物隨著淋洗體積的增大而逐漸被洗出。圖2為11種多環芳烴不同淋洗體積下的回收率，2 mL淋洗多環芳烴回收率為91.89%～108.95%，重質的多環芳烴回收率低于其他淋洗體積，原因可能是重質多環芳烴與分子印跡聚合物結合力相對弱，淋洗時少量重質多環芳烴與甘油三酯一同被洗出。通過優化選擇4 mL作為最優的淋洗體積用量，在保證回收率的前提下，可淋洗出大部分甘油三酯，減少對后續分離檢測的干擾。

圖1 不同淋洗體積條件的優化

圖2 不同淋洗體積時11種多環芳烴回收率

2.1.2 洗脫劑用量的優化

實驗中采用中等極性的二氯甲烷作為洗脫溶劑，對洗脫劑用量進行了優化。本實驗共使用15 mL二氯甲烷洗脫樣品，分三段收集，第一段：0～7 mL；第二段7～10 mL；第三段10～15 mL，并進行液相色譜檢測。結果顯示，第三段洗脫液中未檢出任何多環芳烴組分，第二段洗脫液中檢出少量輕質的PAHs，其他組分在第一段7 mL內被洗脫完全。為保證11種多環芳烴能完全被洗脫，本實驗選取10 mL做為最佳洗脫體積。

2.1.3 色譜條件的優化

實驗中優化了流動相梯度，通過在合適時間改變流動相的比例達到對11種多環芳烴的良好分離(表1)，優化確定了各目標物的最佳發射波長和激發波長(表2)，11種PAHs的色譜圖見圖3。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量下限

11種多環芳烴的線性范圍、檢出限及定量限等見表3，配制11種多環芳烴系列標準溶液進行分析。結果表明，在各自線性范圍內，相關系數(R2)均大于

注：從左到右順序為：蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、、苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(g,h, i)苝和茚并(1,2,3-c,d)芘。圖3 11種PAHs的色譜圖

多環芳烴線性范圍/ng/mL線性關系相關系數/R2檢出限/μg/kg定量限/μg/kg蒽(ANT)0.5～200y= 284 739x+200 8320.999 70.100.33熒蒽(FT)0.5～200y=120 984x+58 9100.999 90.100.33芘(PYR)0.5～200y=253 517x+151 7330.999 70.100.33苯并(a)蒽(BaA)0.5～200y=363 690x+149 3180.999 80.060.20(CHR)0.5～200y=340 938x+171 1160.999 80.050.17苯并(b)熒蒽(BbF)0.5～200y=216 334x+97 0920.999 70.100.33苯并(k)熒蒽(BkF)0.5～200y=1428 669x+487 6410.999 90.030.10苯并(a)芘(BaP)0.5～200y=787 056x-227 8070.999 90.060.20二苯并(a,h)蒽(DahA)1.5～200y= 440 383x+119 5840.999 90.401.30苯并(g,h,i)苝(BghiP)1.0～200y=283 648x+63 6200.999 60.250.83茚并(1,2,3-c,d)芘(IP)5.0～200y=41 398x+13 3920.999 71.505.00

0.999 6，具有非常好的線性關系。對混合標準溶液進行逐級稀釋，以3倍性噪比(S/N)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比計算定量下限(LOQ)。可以看出，苯并芘的LOQ明顯低于我國植物油衛生標準中對苯并芘10 μg/kg的限量要求，同時也低于歐盟2 μg/kg的限量要求，其他未有限量規定的多環芳烴的LOQ也均小于5 μg/kg，說明本方法靈敏度高，完全滿足日常檢測的需要。

2.2.2 準確度與精密度

取橄欖油和大豆油空白植物油樣品，分別添加高、中、低共4個濃度水平的混合標準溶液，按“2.2樣品處理”方法進行處理，每個加標水平進行3次重復實驗，添加濃度、回收率及相對標準偏差(RSD)見表4和表5。11種多環芳烴的回收率均在63.5%～118.6%之間，相對標準偏差為1.2%～10.2%。從表4和表5還可以看出，不同品種的植物油，部分多環芳烴的回收率有差距，說明不同品種油脂組分的差別，對淋洗和洗脫效果有影響。以20 μg/kg的大豆油空白加標樣品比對本方法和國家標準GB 5009.265—2016《食品安全國家標準 食品中多環芳烴的測定》[3]。本方法測定11種多環芳烴含量在15.3～19.8 μg/kg，加標回收率為83.6%～100.9%，相對標準偏差為0.4%～4.9%；而國標方法檢測結果在12.3～18.9 μg/kg，加標回收率為61.7%～94.7%，相對標準偏差為1.2%～15.7%。兩種方法的加標回收率、精密度和準確度上均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中對檢測方法的技術要求，但由于本方法前處理步驟更少，方法快速和簡單，因此在方法準確度和精密度上要優于現有國標方法。

表4 橄欖油11種多環芳烴的加標回收率以及相對標準偏差(n=3)

表5 大豆油11種多環芳烴的加標回收率以及相對標準偏差(n=3)

2.3 實際樣品的測定

應用本方法對本地超市購買的12個植物油樣品進行測定，結果如表6所示，12個植物油中有5種檢出苯并(a)芘，苯并(a)芘檢出率在42%，所有檢出樣品的苯并(a)芘含量均符合我國限量要求，但按照歐盟對植物油中苯并(a)芘的限量要求，則有兩個樣品的結果超標，超標率為16.7%。12個植物油中PAH4均有檢出，且PAH4總量超標率高達75%。從結果上看，植物油中含致癌物和2B類致癌物的PAH4污染較為嚴重，普遍存在，急需加強日常監測。目前我國只對植物油中苯并(a)芘做出限量要求，應加緊制定對植物油中PAH4的限量標準，最大限度保護人民身體健康。

表6 實際植物油樣品的11種多環芳烴檢測結果/μg/kg

注：ND表示未檢出。

3 結論

本研究基于分子印跡固相萃取技術建立了植物油中11種多環芳烴的檢測方法，通過采用分子印跡固相萃取，可有效提高多環芳烴在植物油中的提取率，和標準方法相比，大大減少前處理時間和溶劑成本，同時避免復雜前處理過程導致的目標物損失。11種多環芳烴的回收率均在63.5%～118.6%之間，相對標準偏差為1.4%～18.2%。本方法的定量下限符合國內外對多環芳烴的限量要求，可滿足大量樣品快速、準確定量分析的需要，可用于日常植物油質量安全的檢測和監測工作，進一步保證我國植物油質量安全。