基于GC-MS建立花椒揮發油指紋圖譜及在漢源紅花椒鑒定中的應用

課凈璇 瞿 瑗 黎杉珊 申光輝 羅擎英吳賀君 陳安均 蒲 彪 葉 萌 張志清

(四川農業大學食品學院1，雅安 625014)(四川農業大學林學院2，溫江 611130)

在我國，花椒作為常用的香辛料，深受人們的喜愛[1]。花椒含有豐富的揮發油[2-3]，酰胺類和酮類[4]等活性成分[5]。揮發油不僅是花椒風味物質的主要成分，還有抑菌的功效[6]，因此，花椒在醫藥領域中也有一定的應用價值[7-8]，為食藥同源性食物。我國花椒種植面積較大，主要產地集中在西部地區，如四川、甘肅、云南、陜西等[9]。四川省就有較多花椒生產地區，如漢源，種植較多的品種為大紅袍，唐代列為貢品，故名“貢椒”。以其粒大油重，色澤丹紅、醇麻爽口、芳香濃郁而暢銷省內外[10]；金陽種植較多的品種為竹葉花椒，其顆粒碩大，色澤碧綠，香、麻味純正[11]。陜西鳳縣主要種植品種為大紅袍花椒，以色艷、味濃、粒大，形似雙耳聞名遐邇，被稱為“鳳椒”[12]。甘肅武都主要種植品種為大紅袍，具有粒大飽滿、麻味醇厚、藥效成分多、精油含量高等特點[13]。九葉青花椒最早發現于重慶，該變種具有麻味純正，果實清香等特點[14]。在山西晉東南地區和河北太行山地區栽培較多的品種為小紅椒，又稱小紅袍[15]。大范圍的種植雖然提高了花椒產量，但也造成市面上花椒品種魚龍混雜，質量參差不齊的現狀[16]。花椒與中藥材性質相似，其質量受產地氣候，土壤等因素影響較大。指紋圖譜技術多用于鑒定地道藥材[17-18]，因此可采用該技術建立花椒揮發油指紋圖譜，作為花椒產地鑒別的依據之一。朱琳[19]將氣相色譜-質譜法(GC-MS)技術應用于花椒揮發油成分分析，并建立了花椒揮發油GC-MS指紋圖譜，發現青花椒揮發油指紋圖譜有20個共有峰，紅花椒揮發油指紋圖譜有11個共有峰。張翔[20]以22個不同產地花椒樣品為原料，建立了花椒揮發油和脂肪酸的GC指紋圖譜，并結合聚類分析法，得出花椒樣品之間的相似度和產地分類與其揮發油含量之間存在一定關系，即高揮發油含量產地之間的花椒相似度在0.9以上，非高揮發油含量的產地花椒之間的相似度在0.9以下的結論。

四川漢源紅花椒是國內公認的優質花椒之一，市場上多出現假冒漢源紅花椒，提高售價的情況。因此，本研究擬在建立紅花椒和青花椒指紋圖譜的基礎上，建立漢源紅花椒指紋圖譜，為漢源紅花椒產地鑒別提供依據。

本研究采用水蒸氣蒸餾的方法提取花椒揮發油，并建立花椒揮發油GC-MS指紋圖譜。分析揮發油化學成分差異，結合聚類分析法和主成分分析法對不同產地的花椒揮發油化學成分進行差異分析和分類，確定花椒揮發油成分與產地之間的關系。在此基礎上建立漢源紅花椒揮發油GC-MS指紋圖譜，建立其特征指紋圖譜并確定特征峰，根據其特有成分作為漢源紅花椒產地鑒別的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為產自我國西部主要花椒產地的17個花椒樣品，包含11個花椒樣品(以下按俗稱紅花椒描述)(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和6個竹葉花椒樣品(以下按俗稱青花椒描述)(ZanthoxylumarmatumDC.)，以及產自漢源地區的21個花椒樣品(簡稱漢源紅花椒)。樣品具體產地見表1，于2016年8—10月收集。

無水乙醚、無水硫酸鈉為分析純：成都市科龍化工試劑廠。

表1 17個實驗材料名稱及來源

注：Z1～Z11為紅花椒樣品；Z12～Z17為青花椒樣品；H1～H21為漢源紅花椒樣品。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A-575C氣相色譜-質譜聯用儀；FW-100高速萬能粉碎；SartoriusCP225D型電子天平；98-1-B型電子調溫電熱套。

1.3 方法

1.3.1 花椒揮發油提取

采用水蒸氣蒸餾法提取花椒揮發油。具體操作如下：花椒樣品粉碎后過60 目篩。稱取粉末10.000 g于1 L的圓底燒瓶中，加入400 mL蒸餾水，再加入3～4粒玻璃珠，并連接蒸餾裝置。打開電熱套開關進行加熱，溶液沸騰后，調節電熱套功率，控制油滴以較慢的速度從冷凝管滴下，持續回流4 h。提取完成后，關閉電熱套電源，待裝置冷卻至室溫時，讀出揮發油體積數(mL)。收集得到的揮發油用適量無水乙醚溶解，并加入無水硫酸鈉于-20 ℃下保存過夜。進樣前用0.22 μm的濾頭過濾，即得到供試樣品溶液[21]。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；程序升溫：初始柱溫為50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至100 ℃，保持3 min，最后以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；載氣為高純He；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃，進樣量為2 μL，分流比為40∶1，溶劑延遲時間3 min。

1.3.3 質譜條件

EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描范圍m/z40 ～ 550 amu，NIST 11.1標準譜庫檢索。在相同實驗條件下檢測所有樣品，記錄樣品GC-MS總離子流圖。

1.4 數據分析方法

1.4.1 不同產地花椒揮發油含量差異分析

花椒揮發油含量(mL/100 g)=揮發油體積(mL)/花椒粉末的質量(g)×100

(1)

根據式(1)計算樣品中揮發油含量，并分別計算紅花椒和青花椒揮發油含量平均值。

1.4.2 不同產地花椒揮發油成分差異分析

在相同條件下依次測定38個樣品供試樣液，記錄色圖譜。通過GC-MS系統自帶的NIST 11.1標準譜庫檢索對花椒樣品色譜圖進行定性分析，鑒定花椒揮發油的化學成分。并采用峰面積歸一法確定其相對質量分數。

1.4.3 不同產地花椒揮發油聚類分析

系統聚類分析可根據樣品之間的親疏遠近關系將樣品分類，樣品相似度越大，兩者之間的距離越近。較適合樣品數量較少時的聚類分析，最終輸出樹狀圖的聚類結果[22]。根據本實驗所得花椒揮發油總離子流圖，經過化學成分差異分析，分析不同產地紅花椒和青花椒樣品揮發油的共有峰，并將共有峰峰面積作為花椒揮發油聚類分析的分析對象，將數據導入SPSS 22.0軟件，采用組間連接法，并用歐氏距離的平方(Squared Euclidean Distance)為測度對其進行聚類分析。

1.4.4 不同產地花椒揮發油主成分分析

主成分分析是一種降維的數據分析方法，根據樣品之間的相似度將樣品分成若干組[23]。本實驗將紅花椒和青花椒揮發油共有峰峰面積導入SPSS 22.0軟件，對不同產地花椒樣品揮發油化學成分進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度

取同1份供試品溶液，在1.3.2中同一色譜條件下，連續進樣6次，進樣量2 μL，記錄色譜圖。以芳樟醇為參照峰(S)，計算其他峰保留時間RSD值小于0.93%，峰面積RSD值小于0.83%。

2.1.2 穩定性

取同1份供試品溶液，在1.3.2中同一色譜條件下，于放置 0、2、4、8、12、24 h后分別進樣，進樣量2 μL，記錄色譜圖。以芳樟醇為參照峰(S)，計算其他峰保留時間RSD值小于0.98%，峰面積RSD值小于0.90%。

2.1.3 重現性

取6份同一樣品適量，按照1.3.1中供試品溶液的制備方法制備，在1.3.2中同一色譜條件下，進樣量2 μL，記錄色譜圖。以芳樟醇為參照峰(S)，計算其他峰保留時間RSD值小于0.94%，峰面積RSD值小于0.89%。

精密度，穩定性和重現性實驗中各共有峰保留時間的RSD值小于0.98%，峰面積的RSD值小于0.90%，均小于3%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》(暫行)中的規定[24]。

2.2 不同產地花椒揮發油含量差異分析

揮發油是花椒香氣成分的主要成分，花椒揮發油含量的多少可直接反映花椒的香氣強度[25]。在GB/T 30391—2013中，將花椒揮發油含量是作為反映花椒香氣的理化指標之一[26]。所以，花椒揮發油含量是反映花椒風味物質含量的一項重要指標。通過該指標的測定，結果顯示：紅花椒揮發油含量范圍為5.12～8.34 mL/100 g；青花椒揮發油含量范圍為9.52～11.51 mL/100 g。紅花椒和青花椒揮發油含量的平均值分別為6.86 mL/100 g和10.57 mL/100 g。青花椒揮發油平均含量是紅花椒的1.45倍，顯著性分析結果顯示兩者之間存在極顯著差異(P<0.01)。不同產地花椒揮發油含量結果如表2所示。紅花椒中揮發油含量最多的是越西貢椒，含量最少的是韓城大紅袍。青花椒中揮發油含量最多的是武都青花椒，含量最少的是金陽青花椒。

表2 不同產地花椒揮發油含量的分析結果

注：Z1～Z11：我國西部地區紅花椒樣品；Z12～Z17：我國西部地區青花椒樣品；H1～H21：漢源紅花椒樣品。

2.3 不同產地花椒樣品揮發油成分差異分析結果

在相同實驗條件下依次測定樣品供試液，記錄花椒揮發油GC-MS總離子流圖，如圖1所示。采用NIST 11.1標準譜庫檢索對花椒揮發油色譜圖進行定性分析，結合峰面積歸一法計算各組分相對質量分數，統計匹配度大于95%且相對質量分數大于0.1%的組分。表3～表5分別為紅花椒、青花椒和漢源紅花椒揮發油中主要化學成分(平均相對質量分數大于1%)。

圖1 不同揮發油總離子流圖

編號RTCAS中文名稱分子式相對含量/%123456789101119.259000555-10-2異松油烯C10H163.7690.9771.0370.3451.4550.1392.5161.0592.6501.9011.330210.008000127-91-3β-蒎烯C10H161.8013.3746.1272.7755.8852.9482.292310.490000099-83-2α-水芹烯C10H161.15411.1280.6370.980411.012029050-33-7長松針烯C10H163.6012.2042.5522.2611.806511.548005989-27-5右旋檸檬烯C10H1622.52711.97818.44937.15141.93238.04628.06014.49616.96118.09814.866611.637000470-82-6桉葉油醇C10H166.3882.7632.3565.2361.2695.0362.0643.0807.2274.0232.836711.995003779-61-1反式-β-羅勒稀C10H164.2080.8641.2842.4372.6113.4203.0151.1863.3811.1931.069812.428003338-55-4水芹烯C10H161.8140.9751.5812.8623.1701.8701.4251.4731.3101.124912.854000099-85-4萜品烯C10H165.8432.9173.6244.1233.8435.8013.6783.3501014.132000586-62-9萜品油烯C10H161.6161.0691.3720.3680.3490.3821.3981.3621.6391.2961.2261114.806000078-70-6芳樟醇C10H18O6.10822.93624.98624.23122.6018.19915.12827.2515.15322.61121.1211218.896000098-55-5alpha-松油醇C10H18O5.9928.4703.4272.7982.9895.0058.5053.7605.8145.5901321.789000144-39-83,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇丙酸酯C13H22O21.30424.95212.3789.5368.2089.27811.09812.1571.38719.10523.1631426.621000080-26-2乙酸松油酯C12H20O23.2213.1891.8611.4590.7450.9502.1765.5052.4122.5611527.549000141-12-8乙酸橙花酯C12H20O21.3791.7960.6530.4840.6590.7581.5801.3581.1461628.594000105-87-3乙酸香葉酯C12H20O22.2013.1371.2270.9171.0381.2832.6730.8392.2551.8971733.103023986-74-5大根香葉烯C15H240.9140.8810.4862.4491.7383.6040.4890.3671.2550.4610.6241835.089000483-76-1d-茄烯C15H241.3290.7360.5961.1230.6141.5190.4370.49732.0550.4370.707

表4 青花椒揮發油成分的 GC-MS分析結果

2.3.1 花椒揮發油成分共有峰確認

GC-MS總離子流圖顯示，紅花椒揮發油共確定出16～34個峰，共有峰有8個，其共有峰面積占總峰面積的62.08%。青花椒揮發油共確定出22～33個峰，共有峰為11個，共有峰面積占總峰面積的84.86%。具體結果見表6。該結果表明，不同產地紅花椒揮發油所含化學成分的差異性大于青花椒，即產地對紅花椒揮發油化學成分及其含量的影響大于青花椒。對比兩者共有峰成分可知，紅花椒揮發油共有峰中特有的化學成分有：異松油烯，反式-β-羅勒烯，大根香葉烯和d-茄烯；青花椒揮發油共有峰中特有的化學成分有：α-左旋-蒎烯、長松針烯、萜品烯、側柏酮、4-萜烯醇、1-石竹烯和丁香烯。故紅花椒和青花椒香氣存在一定差異。

2.3.2 花椒揮發油成分差異分析

由NIST 11.1標準譜庫檢索對花椒揮發油色譜圖進行定性分析結果可知，紅花椒揮發油共確認出39種化學成分。其中，萜烯類有21種，醇類10種，醛類1種，酮類2種，酯類5種。青花椒揮發油總離子流圖中共確認出38種化學成分。其中，萜烯類22種，醇類7種，醛類2種，酮類1種，酯類6種。紅花椒揮發油和青花椒揮發油所含化學物質的共同之處在于萜烯類，醇類和酯類含量較多，紅花椒揮發油萜烯類峰面積占總峰面積的49.74%，醇類峰面積占總峰面積的30.81%，酯類峰面積占總峰面積的19.40%；青花椒揮發油中萜烯類峰面積占總峰面積的19.39%，醇類峰面積占總峰面積的78.60%，酯類峰面積占總峰面積的1.51%。對比該三種物質峰面積占總峰面積的百分比可知，紅花椒揮發油含萜烯類物質較多，再次是醇類物質，而青花椒揮發油含醇類物質較多，其次是萜烯類物質。另外，紅花椒揮發油酯類峰面積占總峰面積的比例高于青花椒。故紅花椒和青花椒之間的香氣存在的差異部分原因有可能是由于所含的酯類物質多少的不同引起的。

2.4 聚類分析結果

圖2 GC-MS指紋圖譜聚類分析結果

系統聚類分析結果如圖2所示。結果表明我國西部17個產地的花椒分成兩大組，其中紅花椒和青花椒分別為一組，說明紅花椒揮發油和青花椒揮發油之間存在著較顯著的差異。Z12 ～ Z17樣品為青花椒，被分為一組(組Ⅰ)，且樣品之間的距離較近，表明不同產地青花椒揮發油化學成分相似性較大。我國西部紅花椒樣品被分為一組，其中根據樣品之間的距離又可以將其分為兩組(組Ⅱ和組Ⅲ)。組 II包含5個樣品，即Z2、Z3、Z8、Z10和Z11。其中Z8和10都是來自甘肅武都的紅花椒，兩者產地一樣，被聚類為同一組。組Ⅲ包含6個樣品，即Z1、Z4、Z5、Z6、Z7、Z9。其中Z4產地為四川涼山越西，Z5和Z6的產地為四川漢源，但在地理位置越西與漢源為臨近區縣，Z5和Z6兩個樣品在聚類譜系樹狀圖中的距離也最接近。表明其揮發油化學成分相似性較大，故紅花椒揮發油成分受產地的影響較大。

2.5 主成分分析結果

將花椒揮發油共有峰峰面積導入SPSS 22.0 軟件，取特征值在1.0以上的主成分進行分析。結果表明，特征值在1.0以上的主成分共有3個(PC1、PC2和PC3)。主成分PC1、PC2和PC3在分析模型中的貢獻率分別為66.30%、12.97%和8.40%。故

表5 漢源紅花椒揮發油成分的 GC-MS分析結果

表5續

可根據這三個主成分即可概括分析不同產地花椒揮發油之間的相似性。根據主成分PC1，PC2和PC3得分繪制三維散點圖，如圖3所示。17個花椒樣品被分為4組，其中組Ⅰ包含Z2、Z7、Z8、Z10和Z11。這五個樣品在PC1、PC2和PC3的得分都是負值。與聚類分析結果相似，Z8和Z10也被分到同一組。組Ⅱ包含Z1、Z3和Z9，這三個樣品在PC1和PC2的得分都是負值，在PC3的得分為正值。與聚類分析結果一致，組Ⅲ包含Z4、Z5和Z6，這三個樣品在PC1得分為負值，PC2得分為正值，PC3得分在0附近。組Ⅳ包含所有的青花椒樣品，在PC1和PC2得分都是正值，在PC3上得分在0附近。所檢測的青花椒被分為同一組，分布較為集中，說明青花椒揮發油之間的差異受產地的影響較小，紅花椒揮發油之間的差異受產地的影響較大，該結論與本研究聚類分析實驗結論一致。

圖3 GC-MS指紋圖譜主成分分析結果

2.6 GC-MS指紋圖譜技術在漢源花椒產地鑒定中的應用

2.6.1 漢源紅花椒揮發油含量分析

由表2可知，漢源花椒揮發油含量在4.56～9.57 mL/100 g之間，平均含量為7.34 mL/100 g，高于我國西部地區各產地紅花椒揮發油含量的平均值(6.86 mL/100 g)。漢源花椒揮發油含量在4.46～6.86 mL/100 g之間的樣品有8個，其余13個樣品(61.90%)揮發油含量均高于6.86 mL/100 g，即超過一半的漢源花椒樣品揮發油含量高于我國西部地區各產地紅花椒揮發油含量的平均值。表明漢源紅花椒揮發油整體含量較高。

2.6.2 漢源紅花椒樣品揮發油成分特征性分析

漢源紅花椒揮發油總離子流圖共確定出16 ～ 35個峰，共有峰有11個，共有峰面積占總峰面積的78.69%。漢源紅花椒共有峰和我國西部地區紅花椒相比，共有峰個數多出2個，共有峰面積占總峰面積比例高出16.61%，即漢源紅花椒揮發油化學成分較一致。其揮發油共確認出39種化學成分，萜烯類20種，其峰面積占總峰面積的62.64%；醇類11種，其峰面積占總峰面積的23.28%；酯類6種，其峰面積占總峰面積的13.49%。酮類1種，其峰面積占總峰面積的0.24%；酸類1種，其峰面積占總峰面積的0.19%。漢源紅花椒共有峰特征物質與我國西部地區紅花椒共有峰特征物質之間對比情況如表6所示。由表6結果可知，漢源紅花椒共有峰中特有的化學成分有5種，即崖柏烯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯和1-石竹烯，故該5種成分可作為漢源紅花椒揮發油的特征成分，作為漢源紅花椒產地鑒定的依據之一。

表6 我國西部地區紅花椒、青花椒和漢源紅花椒共有峰特征物質之間的對比結果

3 討論

揮發油是花椒風味物質的主要成分之一，是生產花椒精油時首要檢測的重要經濟價值指標。本實驗采用GC-MS技術，測定花椒揮發油總離子流圖，建立紅花椒和青花椒揮發油GC-MS指紋圖譜，并對其進行差異分析。結果表明青花椒揮發油含量與紅花椒揮發油含量之間存在極顯著差異，該結論與朱琳研究結果一致[19]。

兩種花椒揮發油鑒定出的化學成分種類基本一致，通過對紅花椒和青花椒揮發油指紋圖譜差異分析，發現青花椒揮發油共有峰數多于紅花椒，且青花椒共有峰面積占總峰面積的84.86%高于紅花椒(62.08%)。結果表明，不同產地青花椒揮發油化學成分較一致，不同產地紅花椒揮發油成分差異較大，該結論與羅凱等[27]采用同時蒸餾萃取法提取不同地紅花椒和青花椒揮發油，采用氣質聯用的方法測定揮發油成分，得出青花椒揮發油成分共有成分占總峰面積百分比大于紅花椒的結論一致。根據兩種花椒揮發油成分對比結果可知，青花椒和紅花椒揮發油主要成分都為萜烯類、醇類。該結論與楊靜等[28]的研究結果一致。但紅花椒揮發油中含萜烯類物質較多，青花椒揮發油含醇類物質較多。對比具體化學成分可知，紅花椒揮發油所含檸檬烯較多，占總峰面積的23.87%，是青花椒揮發油(13.22%)的1.8倍。青花椒揮發油含芳樟醇較多，占總峰面積的64.77%，是紅花椒揮發油的(19.12%)3.39倍。該結論與石雪萍等[29]采用水蒸氣蒸餾法提取紅花椒和青花椒揮發油并測定其主要成分，得出青花椒和紅花椒主要成分為醇類物質和烯類物質，且青花椒芳樟醇含量是紅花椒的3倍的結論一致。檸檬烯和芳樟醇是花椒揮發油主要化學成分，其含量多少會影響花椒風味[30]，所以，青花椒和紅花椒之間的香氣差異可能是由于檸檬烯和芳樟醇含量的不同引起的。

紅花椒揮發油非共有峰占總峰面積的37.92%，所占比例較高，所以紅花椒揮發油非共有物質可作為產地鑒定的依據。根據聚類分析和主成分分析結果可知，不同產地青花椒樣品被分為一組，樣品之間的相似性較大。而紅花椒被分為2～3組，所以紅花椒揮發油所含化學成分受產地的影響較大。該結論與陳光靜等[21]采用GC-MS技術分析不同產地紅花椒揮發油成分差異，得出樣品間香氣的品質的差異受揮發油含量和組分差異有關，并可將該兩種指標作為紅花椒產地鑒別的依據之一的結論一致。因此可以根據紅花椒揮發油中某種特有成分作為該產地紅花椒鑒別的依據。由表6可得知，漢源紅花椒揮發油特有成分有5種，該5種物質可以作為漢源花椒產地鑒定的指標之一。且漢源花椒含有獨特的乙酸松油酯，乙酸橙花酯和乙酸香葉酯，這三種物質在揮發油中的含量雖然不是最多的，但是對漢源紅花椒優質的香氣具有一定的貢獻作用。即本實驗探索出了漢源紅花椒揮發油中的特有物質，可作為其產地鑒定時的依據之一。由于本實驗只以當季花椒為實驗材料，測定其揮發油成分，未涉及非當季花椒，所以本實驗結果只適用于當季花椒的鑒定。非當季花椒揮發油成分與產地之間的差異尚待研究。

4 結論

本實驗采用水蒸氣蒸餾的方法提取花椒揮發油，發現青花椒揮發油含量是紅花椒揮發油的1.45倍，兩者之間存在極顯著差異。采用GC-MS技術，建立我國西部地區紅花椒和青花椒揮發油指紋圖譜。根據化學成分差異分析結果結合聚類分析法和主成分分析法結果，表明不同產地青花椒揮發油之間相似性較大，不同產地紅花椒揮發油化學成分差異較大，可以將紅花椒揮發油非共有組分作為花椒產地鑒別的依據。根據本實驗的方法建立漢源紅花椒揮發油指紋圖譜。經分析，崖柏烯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯和1-石竹烯5種物質可作為漢源紅花椒產地鑒定的依據。