B7-1、B7-2單抗對狼瘡腎炎小鼠模型的免疫干預及機制研究

韓蓮花，沈立軍，朱 瑩，邱玉華

0 引言

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)屬于臨床上育齡女性發病率高于男性的自身免疫性疾病。SLE患者的免疫系統處于高度活躍狀態，尤其是B淋巴細胞功能異常，體內產生多種自身抗體，自身抗原抗體結合而成的免疫復合物在機體的器官和組織沉積。這些免疫復合物的沉積可能造成各個臟器和組織發生不可逆的功能破壞和喪失，包括血管、皮膚、關節、心肺、腎臟等。SLE的具體發病機制尚未明確，與環境、內分泌等多方面因素有關。SLE的治療主要以糖皮質激素、免疫抑制劑為主。但長期使用這些藥存在多種不良反應，給患者帶來了各種嚴重的并發癥。因此，如何尋找有效、不良反應少的新的治療方法一直是SLE的研究熱點[1]。

B7分子是表達在抗原遞呈細胞(APC)，包括B淋巴細胞、樹突狀細胞、單核巨噬細胞等細胞表面的協同刺激分子，主要包括B7-1(CD80)及B7-2(CD86)。B7-1和B7-2分子都是跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，兩者氨基酸序列有25%的同源性[2]。B7分子主要是和表達在T細胞表面的CD28/CTLA-4結合產生相應的作用，與CD28結合刺激T淋巴細胞活化，促進特異性T細胞的增殖、特異性細胞因子的分泌；而與CTLA-4結合則轉導抑制性信號，終止T細胞活化[3]。機體在T細胞免疫應答中，如果缺乏B7/CD28共刺激信號，T 細胞可能進入無反應狀態、免疫耐受，甚至是發生細胞凋亡。多項研究表明，B7/CD28 共刺激信號通路的過度活化與多種自身免疫性相關疾病的發生發展密切相關，如SLE 患者的細胞表面存在過度表達的B7-1和B7-2分子[4-5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料 B7-1鼠源性單克隆抗體4E5、B7-2鼠源性單克隆抗體1D1均由本實驗室研制。6～8周齡體重25～30 g的雌性BALB/c小鼠20只，雄性C57BL/J6小鼠10只(上海斯萊克實驗動物中心)。ANA(抗核抗體)，anti-dsDNA(抗雙鏈DNA抗體)檢測試劑盒(北京和杰創新生物有限公司)；FITC羊抗小鼠IgG(cell signaling公司)；尿蛋白(Albustix)檢測試紙(美國Bayer公司)。熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，低速離心機(Eppendorf公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 cGVHD狼瘡樣小鼠模型的建立 雄性C57BL/J6×雌性BALB/c雜交F1代小鼠，取60只雌性F1代小鼠分成4組：正常對照組，模型組，B7-1干預組，B7-2干預組。模型建立方法參考本實驗室相關試驗[6]。B7-1干預組、B7-2干預組在淋巴細胞注射后的第1、3、5、8、15、30、60天，分別通過尾靜脈注射B7-1單抗、B7-2單抗，每只小鼠注射抗體量為8 mg/kg，模型組在相同時間注射等劑量的小鼠Ig同型對照。

1.2.2 血清dsDNA、ANA的檢測 各組實驗小鼠每周眼眶采血1次，收集血清用于檢測dsDNA、ANA。血清用PBS 1∶100稀釋，dsDNA采用間接免疫熒光法檢測：每個血清標本20 μl與抗原片室溫避光孵育30 min，洗滌后加入抗dsDNA的熒光二抗20 μl，室溫孵育30 min后，再次洗滌，封片后熒光顯微鏡下觀察。抗dsDNA 抗體陽性時表現為均質或環狀熒光，熒光為一大一小成對出現，陰性時四膜蟲蟲體內無熒光。ANA的檢測通過HEp-2細胞片完成，將待測血清，陽性對照和陰性對照20 μl加到抗原片上，濕盒室溫孵育30 min。然后浸泡至洗片缸內清洗，清洗后每孔滴加20 μl FITC-羊抗鼠抗體，濕盒室溫孵育30 min。再浸泡清洗，最后滴加封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.3 實驗小鼠尿蛋白的檢測 各組實驗小鼠每隔2周的清晨刺激留尿，將小鼠的新鮮尿液滴加到尿蛋白檢測試紙的反應顯色區。放置1 min后，顯色區顏色發生改變，根據顯色區顏色深淺和標準色帶對比來判斷蛋白尿的嚴重程度，根據標準色帶將蛋白尿分為陰性(-)和5個陽性(±、+、++、+++、++++)級別。

1.2.4 實驗小鼠腎臟組織HE染色 各組實驗小鼠觀察至12周全部處死，取出兩側腎臟，將其中一側放于福爾馬林中固定，切片，貼片，脫蠟，水化，HE染色，染色后再脫水，透明，最后用中性樹膠封片，封片完置于病理顯微鏡下，觀察腎臟組織腎小球形態的改變。

1.2.5 實驗小鼠腎臟超微結構的改變 將實驗小鼠的腎臟取出后，迅速切成立體小塊(約1 mm×1 mm×1 mm)，然后立即投入2.5%戊二醛固定液固定1 h，固定完用PBS漂洗3次，再放入1%鋨酸固定液中固定1 h。浸泡入梯度丙酮進行脫水，每次10 min。將組織塊包埋在多孔橡膠模板中，放入烤箱烘干至形成包埋塊。對包埋好的組織進行切片，切好的組織片在醋酸鈾溶液中染色2 h，封好的切片置于透射電鏡下觀察。

1.2.6 實驗小鼠腎臟免疫復合物沉積情況 將腎臟組織放入4%多聚甲醛固定6 h，20%蔗糖組織沉底，OTC包埋冰凍組織塊，切片，貼片，純丙酮處理后風干。PBS洗滌3次后BSA室溫封閉1 h，滴加FITC直標羊抗小鼠IgG避光4 ℃孵育過夜，第2天用PBS洗滌2次，樣本上滴加防淬滅劑后封片，最后置樣本于熒光顯微鏡下，觀察沉積在腎臟組織的免疫復合物情況。

2 結果

2.1 血清dsDNA、ANA的表達變化 模型組小鼠第2周就能檢測到dsDNA的表達，第4周能檢測到ANA的表達。B7-1干預組第4周能檢測到dsDNA的表達，第6周能檢測到ANA的表達。B7-2干預組第6周能檢測到dsDNA的表達，第8周能檢測到ANA的表達。抗體滴度都低于模型組。見圖1、圖2。

2.2 尿蛋白的變化情況 在第8周，模型組有小鼠檢測到陽性蛋白尿的發生，數量為50%，到第12周，所有模型組小鼠都檢測到了蛋白尿(++～++++)。第12周，B7-1干預組和B7-2干預組小鼠也都檢測到陽性蛋白尿，B7-1干預組有50%的小鼠檢測到蛋白尿，尿蛋白含量+～++。B7-2干預組有40%的小鼠檢測劑蛋白尿，尿蛋白含量+～++。見表1。

表1 12周各組小鼠尿蛋白程度

注：*與模型組比較，P<0.05

2.3 腎臟病理結構改變 模型組的腎臟組織切片可見組織結構發生較大的改變，基本結構破壞嚴重，腎小球內可見大量的炎性細胞浸潤，腎小球的體積大于對照組，內皮細胞和系膜基質都發生不同程度的增生，從而導致腎小球囊腔發生狹窄甚至閉塞。B7-1干預組腎小球內有少許炎性細胞，腎小球體積輕微增大，毛細血管腔和腎小球囊腔未變窄。B7-2干預組腎小球內也有少許炎性細胞，腎小球體積輕微增大，毛細血管腔和腎小球囊腔結構未發生變窄情況，兩組干預組的腎臟結構基本未發生破壞，病理改變較小。見圖3。

2.4 腎臟超微結構改變 電子顯微鏡下可見，對照組腎小球超微結構正常，上皮細胞足突結構明顯，基底膜厚度均勻。模型組上皮細胞足突消失，在臟層上皮和基底膜之間存在大量的駝峰狀電子致密物，基底膜發生節段性增厚。B7-1干預組的臟層上皮和基底膜之間也發現少量電子致密物，基底膜厚度均勻，未見明顯增厚部位。B7-2干預組臟層上皮和基底膜之間可見少量電子致密物，基底膜也未見明顯增厚部位。見圖4。

2.5 腎臟免疫復合物沉積 模型組小鼠的樣本上可見多處顆粒狀或線性的熒光，熒光能大致顯示腎小球輪廓，主要聚集在腎小球毛細血管襻位置，提示有免疫復合物在腎小球部位沉積。B7-1干預組樣本上也可見少量顆粒狀熒光，但熒光的分布和強度都較模型組減弱。B7-2干預組也可見少量顆粒狀熒光，熒光的分布和強度也明顯弱于模型組。見圖5。

圖1 各組小鼠12周時血清dsDNA的表達(400×)

圖2 各組小鼠12周時血清ANA的表達(400×)

圖3 各組小鼠腎臟組織HE染色(400×)

圖4 各組小鼠腎臟組織電鏡下超微結構改變

圖5 各組小鼠腎臟免疫復合物沉積(400×)

3 討論

機體在發生正常的免疫應答中，T淋巴細胞需要經過活化、增殖、分化才能發揮生物學效應，而生物學效應的發揮需要兩個必要信號的參與：抗原肽-MHC復合體與T細胞受體結合的特異性信號和APC表面協同刺激分子與其受體結合的非特異性信號[7]。

B7分子是目前T細胞活化眾多協同刺激分子中最重要的分子之一，主要與T細胞表面的CD28、CTLA-4結合，從而影響免疫應答過程細胞的分化[8-9]。B7和T細胞表面受體結合主要誘導CD4+T細胞向Th1細胞分化(分泌細胞因子IL-4、IL-5、IL-10等)，以及CD8+T細胞向CTL分化；B7-2則主要誘導CD4+T細胞向Th2細胞分化以及分泌細胞因子IFN-γ、IL-2等[10]。

SLE患者細胞表面B7-1 和 B7-2分子均過度表達，不管是在靜息還是活化的B細胞表面，SLE患者B7-2分子的表達都比正常人明顯增多，而B7-1在靜息B細胞上的表達和正常人沒有顯著差異，只在活化的B細胞上表達比正常人明顯增多。Takasaki等[11]報道，B7-1和B7-2分子的過度表達不僅僅發生在B細胞表面，在CD3+T細胞表面的表達也增加。在SLE患者皮膚的皮損區、表皮和真皮上的APC細胞上也過度表達了B7-1和B7-2 分子。然而，應用激素治療后，皮損區APC細胞上的B7-1和B7-2分子的mRNA和蛋白的表達都減弱甚至消失[12]。

B7-CD28信號通路參與了SLE的發生發展，并發揮重要作用。通過B7-1和B7-2的單抗來調控B7-CD28信號通路，改變T細胞的反應性，可以減輕SLE模型的過度免疫活化狀態，減少自身抗體的產生，甚至可能消除SLE模型所發生的組織學變化[13-14]。Finck等[15]通過給NZB/NZW F1(B/W) SLE模型鼠注射了B7-1和B7-2的拮抗劑CTLA-4Ig，從而阻斷了模型鼠自身抗體anti-dsDNA的產生，減輕了腎小球和腎間質病變，改善了腎炎癥狀。在 B7-1 和 B7-2 雙敲除的 MLR-Fas/lpr模型小鼠中，小鼠的多種細胞因子如IFN-γ 及 IL-12 表達量均下降，自身抗體滴度也明顯減少，SLE的各種癥狀得到緩解，蛋白尿消失，腎臟的病理損害減輕[16]。

本次研究對模型組小鼠分別使用B7-1、B7-2單克隆抗體進行干預治療，在自身抗體、腎臟病理改變、蛋白尿的產生、腎小球免疫復合物沉積方面與模型組小鼠比較，都得到了一定程度的改善。同時，B7-1干預組、B7-2干預組治療的結果并不完全相同。在自身抗體方面，B7-2抗體治療組對自身抗體的抑制作用優于B7-1干預組。可能是因為B7-2主要參與Th2介導免疫抗體的產生，而SLE疾病正是由于出現了T細胞的異常分化，出現了過多的Th2細胞，從而輔助了抗體生成細胞的激活和增殖，使自身抗體異常分泌，自身抗體和自身抗原結合物造成了很多關節和組織的破壞[17-18]。

SLE患者的抗原提呈細胞表面高度表達B7-2，可能是患者的抗體生成細胞發生了過度激活和增殖，從而產生自身抗體的始動因素之一。因此，B7-2干預組對抗體生成細胞起到了特異性的抑制作用，因此延緩和減少了自身抗體的產生。自身抗體和抗原形成的免疫復合物會在全身各個部位沉積，腎臟是受損害最嚴重的器官，狼瘡性腎炎是SLE患者最常發生和最嚴重的并發癥，甚至是很多患者死亡的主要原因。B7-2治療組通過減少自身抗體的產生減輕了腎臟病理損傷，延緩了小鼠狼瘡性腎炎的發生發展。

B7-1干預和B7-2干預都降低了機體的早期免疫應答，減輕了腎臟的病理損傷。B7-2干預能更特異性地減少自身抗體的產生，因此對模型小鼠腎炎的發生發展有更好的延緩作用。阻斷B7-CD28通路在一定程度上抑制了狼瘡樣腎炎小鼠的異常細胞免疫應答，可在一定程度上防治和改善疾病病情。關于SLE和其他自身免疫性疾病的研究還在進行中，通過減弱或阻斷協同刺激分子介導機體免疫應答所必需的非特異性信號通路的治療方法有望為SLE等自身免疫性疾病提供高效低毒的生物療法。