醬香型白酒釀造中放線菌多樣性及功能研究概述

王珂佳，邱樹毅*

（1.貴州輕工職業技術學院 輕工化工系，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

醬香型白酒是我國特有的傳統白酒，以貴州茅臺酒和四川郎酒為主要代表，其釀造歷史可追溯至秦漢時期，經不斷發展，形成了以高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫流酒、生產周期長和貯存時間長為特點的“四高兩長”生產工藝[1-2]。醬香型白酒發酵過程涉及細菌、霉菌和酵母菌等各種微生物共同作用[3]，其中，細菌是產香動力來源、霉菌是糖化動力來源、酵母菌是發酵產酒精和產高級酯類動力來源[4]，放線菌的次生代謝產物在醬香型白酒釀造過程中具有一定的生物調控作用[5]。

放線菌（actinomycetes）是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強大的原核生物，屬于革蘭氏陽性、化能異養型細菌[6]，含有大量鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C），因其呈放射狀生產而得名，以孢子繁殖和斷裂生殖，大多數菌種均能耐高溫，在自然界中廣泛分布于熱泉、高溫堆肥中[7-8]，迄今已發現和形態描述放線菌約3 000余種，代表屬有鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、小單孢菌屬（Micromonospora）等[9]。放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，被廣泛報道為抗生素的來源[10-11]，同時，放線菌還能產生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等各種酶及維生素B12（vitamin B12，VB12）和有機酸等，此外，放線菌還可用于甾體轉化、烴類發酵、石油脫蠟和污水處理等方面[12-14]。近年來，針對醬香型白酒釀造中放線菌的分離篩選研究不斷見諸報道[4-5，15]，為開展醬香型白酒釀造中放線菌多樣性研究奠定了基礎；同時，對于放線菌在醬香型白酒釀造中功能研究也取得了一定成果。本文圍繞醬香型白酒釀造中放線菌多樣性及其功能，綜述了醬香型白酒釀造過程中放線菌的研究現狀，分析了放線菌在醬香型白酒釀造過程中次生代謝產物對醬香風味形成影響及生物調控的作用機制，展望了白酒中放線菌未來研究前景，為今后開發高溫放線菌資源及功能，提升醬香型白酒品質奠定基礎。

1 醬香型白酒釀造中放線菌多樣性研究

醬香型白酒是在開放環境中，基于“多微共酵”的固態發酵方式進行生產[16]，其獨特的制曲和制酒工藝需將溫度控制在較高水平，各種釀酒微生物經過長期高溫馴化，大量耐高溫菌株得以富集[17]。目前，研究人員在醬香型白酒釀造過程中發現的放線菌絕大多數為高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae），該科共有14個屬，分別為高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、黃色高溫微桿菌屬（Thermoflavimicrobium）、清野氏菌屬（Seinonella）、萊斯氏屬（Laceyella）、直絲菌屬（Planifilum）、邁勒吉爾霉菌屬（Melghirimyces）、島津氏菌屬（Shimazuella）、鏈孢子菌屬（Desmospora）、徐氏菌屬（Lihuaxuella）、海洋絲狀菌屬（Marininema）、皂-洛克菌屬（Mechercharimyces）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、多分枝霉菌屬（Polycladomyces）和海森氏菌屬（Hazenella）[18]。

1.1 醬香型白酒制曲發酵過程中放線菌多樣性研究

俗話說“，曲為酒之骨”，曲是白酒釀造主要的糖化劑和發酵劑，為白酒釀造提供豐富的菌源和可利用的熟淀粉，促進原料邊糖化邊發酵，對白酒香型形成具有重要作用。醬香型白酒釀造所使用的是以純小麥為原料加入母曲，在65℃條件下經60 d左右固態自然發酵所形成的高溫大曲。在開放式的制曲過程中，來自空氣、水、原料、器具和場地環境等方面的微生物富集在大曲中，形成復雜而多樣的微生物體系，主要包括細菌、霉菌和酵母菌[1，3]。目前，針對醬香型大曲中放線菌多樣性研究逐漸受到重視。

20世紀80年代，沈陽市食品發酵研究所對茅臺酒廠、長沙酒廠、常德酒廠及吳川酒廠所使用醬香大曲在培養過程中微生物消長情況進行研究，其結果表明，放線菌的數量均多于霉菌[19]。1992年，中國科學院成都生物研究所在涼山州曲酒廠的醬香型酒曲中，分離出較大數量的高溫放線菌[20]。高亦豹[21]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術（polymerase chain reaction-denaturing gradientgelelectrophoresis，PCR-DGGE）研究中國白酒大曲微生物群落結構過程中，檢測到Thermoactinomyces sanguinis屬于高溫放線菌屬。2001-2006年，范光先等[22]對茅臺酒制曲發酵過程中微生物的消長情況進行了研究，共分離得到微生物97種，其中放線菌4種。王曉丹等[23]采用Roche454 FLX+高通量測序平臺對貴州3種醬香型白酒高溫大曲中細菌類群組成進行了研究，發現高溫放線菌屬在3種醬香大曲中均為優勢菌屬，含量均超過34%，最高達到66.10%。王芙蓉等[24-25]利用GTY培養基和ISP2培養基從醬香型大曲中成功分離得到1株放線菌F6，經鑒定菌株F6為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）。尤小龍[26]從醬香型白酒釀造過程中成功分離出25株放線菌，其中，10株分離自大曲，大曲中放線菌數量與窖皮泥中一致且大于酒醅。羅小葉等[27]在28℃條件下先干熱處理再濕熱處理對樣品進行預處理后分別利用高氏一號培養基、ISP2培養基、淀粉-甘油培養基從茅臺大曲中分離出3株放線菌，其中菌株FBKL4.001、FBKL4.002鑒定為可可鏈霉菌（Streptomyces cacaoi）、菌株FBKL4.003鑒定為沙阿霉素鏈霉菌（Streptomyces zaomyceticus）。李豆南等[28]從醬香型大曲中成功分離得到1株具有耐高溫特性的放線菌FBKL4.005，經全基因組測序和序列分析發現菌株FBKL4.005拼接基因組在屬水平上與現有的鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）基因組核酸序列相似性在57.50%左右，總體相似度最高；而在種水平上則與吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）具有14.82%最高相似性。同時，還發現一株耐熱性良好的放線菌FBKL4.010，通過形態學、生理生化特征鑒定、16S rRNA基因序列分子生物學鑒定，確定該菌株歸屬于高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae）萊斯氏菌屬（Laceyella sp.），經過進一步系統發育樹比對分析鑒定為糖萊斯氏菌（Laceyella sacchari）[3]。

目前，使用傳統純培養方法在醬香型大曲中僅能發現少數的放線菌，而利用基于現代分子生物學技術的免培養法則發現許多未培養高溫放線菌，且與芽孢桿菌一樣為主要的優勢菌群。同時，也建立了從醬香大曲中有效分離篩選放線菌的方法，為研究醬香型大曲中放線菌多樣性及其功能奠定了基礎。

1.2 醬香型白酒制酒發酵過程中放線菌多樣性研究

醬香型白酒在制酒過程中需經8輪次發酵，每輪次包含高溫堆積發酵和入窖發酵兩個環節，為期1個月。第1輪次稱為“下沙”，加總量50%的高粱和投料量12%的大曲、第2輪次稱為“糙沙”，加總量剩余50%的高粱和適量大曲，第3～8輪次稱為“回沙”，只加大曲不再投料[2]。在整個制酒發酵過程中，大曲與高粱混合發酵制成的酒醅、發酵池中窖泥以及環境中所包含的微生物共同作用對醬香型白酒風味的形成產生影響。近年來，研究者們在從醬香型大曲中成功分類鑒定出具有生物學功能的放線菌基礎上，將研究范圍從大曲擴展到酒醅、窖泥，并取得了一定成果。

1981年，崔福來等[19]采用平板稀釋法從醬香型武陵酒第六輪發酵的酒醅中發現了少量放線菌存在。2001-2006年，貴州茅臺酒廠技術中心對茅臺酒制酒堆積發酵和入窖發酵過程中微生物多樣性進行了研究，從酒醅中分離得到微生物85種，其中細菌41種，酵母28種，霉菌16種，未發現放線菌存在[22]。2014年，黃治國等[29]利用傳統的分離純化技術和Biolog自動微生物鑒定技術，首次從醬香型白酒酒醅中分離純化得到一株伴放線菌嗜血菌。2014年，程才瓔等[30]運用PCR-DGGE技術對醬香型白酒連續七輪次堆積前期、堆積中期、堆積后期酒醅細菌群落結構進行了研究，克隆測序分析結果表明，醬香型白酒酒曲細菌群落結構多樣性高于所有堆積酒醅。高溫放線菌屬（Thermoactinomycetaceae）是酒曲和所有堆積酒醅樣品中共有的優勢菌群之一，鏈霉菌屬（Streptomyces）是釀酒酒質最好的第三、四、五輪次酒醅中共有的優勢菌群之一。2016年，尤小龍[26]從醬香型白酒生產過程中所使用的大曲、酒醅、窖皮泥中成功分離出25株放線菌，其中，5株分離自酒醅，10株分離自窖皮泥，且窖皮泥中的放線菌數量與大曲中一致。2017年，白成松等[31]從茅臺地區醬香型酒糟中篩選出一株耐高溫放線菌株，通過16S rDNA基因序列分析以及系統發育樹分析，鑒定為產色高溫單孢菌（Thermomonospora chromogena）。2017年，韓興林等[32]采用高通量測序技術對醬香白酒高溫堆積酒醅中原核微生物結構進行了系統分析，共檢出馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、白蟻菌屬（Isoptericola）、考克氏菌屬（Kocuria）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）等11個高溫放線菌屬。2017年，黃蘊利等[33]通過IlluminaM iSeq平臺研究分析醬香型白酒第二輪次發酵過程生產堆積、窖池發酵酒醅中的微生物多樣性及其主要功能群落結構，結果表明在堆積酒醅中存在少量高溫放線菌屬，占比1.37%。

在醬香型白酒釀造過程中，放線菌在酒醅中的含量較少，遠低于大曲中的含量水平，且利用傳統純培養方法分離鑒定難度大，靈敏度不高。高通量測序等現代檢測技術的發展，促進了酒醅中放線菌的深入研究。

放線菌大部分屬于土壤放線菌，在醬香型白酒釀造過程中，經研究表明其在窖皮泥中含量與大曲中相當，但是目前針對窖皮泥中放線菌的研究屈指可數，尚未引起研究者們的重點關注。

1.3 醬香型白酒釀造環境中放線菌多樣性研究

醬香型白酒是在開放性環境中進行生產的，環境中的微生物是醬香酒生產微生物的重要來源，無論是高溫制曲，高溫堆積發酵還是入窖發酵，都會網羅環境微生物參與其中。放線菌主要分布在土壤和空氣中，因此對于釀造環境中放線菌多樣性的研究也是一個重點領域。

2003年，蔣紅軍[34]研究發現，在茅臺酒生態環境中放線菌盡管數量少，但也是釀造微生物中的一大類。2004-2006年，貴州茅臺酒廠技術中心對茅臺鎮周邊的土壤、水源及空氣中的微生物進行了普查，分離檢測到147種微生物，至少50種與茅臺酒生產過程中發現的微生物種相同，其中放線菌有4種[22]。2014年，楊帆等[35]利用高氏平板從醬香型白酒生產環境土壤中篩選分離得到1株放線菌NS01，利用形態學、16S rRNA序列同源性鑒定目的菌株為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）。2014年，張亞麗[36]通過對貴州省仁懷地區茅臺鎮空氣微生物進行鑒定與分析發現，醬香型白酒在釀造過程中有很大一部分微生物來自于所處的空氣環境中，采用固體撞擊法對貴州省仁懷市茅臺古鎮已選定的5個采樣點進行空氣微生物采集，經培養共分離鑒定微生物800余株，300余種，其中包括霉菌、放線菌等。

環境中微生物菌群在醬香型白酒制曲、制酒生產中，對醬香風味形成具有一定影響，但目前對醬香型白酒釀造環境中微生物研究相對較少，主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等細菌和嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）等霉菌上[36-39]，且程度不深，對于細菌中放線菌更是未被重視。因此，對醬香型白酒釀造環境中微生物多樣性進行深入研究，開展放線菌相關研究，為保證醬酒品質提供更豐富的理論支撐。

2 醬香型白酒釀造中放線菌功能研究

作為一類重要的釀造微生物，相關研究表明放線菌的次生代謝產物在白酒釀造過程中具有一定的生物調控作用[40]。

2.1 放線菌次生代謝產物對于醬香風味形成的研究

醬香型白酒獨特風味是基于特殊的生產工藝和地理環境下多種微生物協同作用形成的，作為醬香型白酒釀造過程中的重要微生物菌群，研究放線菌次生代謝產物在醬香風味形成方面的作用機制具有重要意義。

尤小龍等[5]通過液相色譜-質譜聯用（liquid chromatographmasspectrometrometry，LC-MS）和衍生化后高效液相色譜技術，對從醬香型白酒生產過程分離出的白色鏈霉菌（Streptomycesalbus）S5的代謝產物進行研究，結果表明：其所代謝出的具有生物活性的物質為鹽霉素（salinomycin），在發酵液中其質量濃度約為210μg/L。

李豆南等[15]采用頂空固相微萃取（headspace solid phasemicroextractions，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gaschromatgraphymassspectrometrometry，GC-MS）聯用技術，對從醬香大曲中分離得到的一株耐熱性良好的放線菌FBKL4.010的次生代謝產物進行研究，結果表明，該菌株能代謝產生大量四甲基吡嗪，其含量占總揮發性成分的43.318%，四甲基吡嗪被研究證明為醬香風味的主體成分[42-44]。

羅小葉等[27]對從醬香大曲中分離得到的3株放線菌進行固態發酵，并通過頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術，對其揮發性成分組成及成分風味進行了測定。結果表明，3株菌固態發酵揮發性成分以酯類物質為主，分別占62.80%、59.23%、46.77%，且均能產生吡嗪類物質，此外還能產生少量酮類、醛類、酚類等物質。

張建敏[41]采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術，對從醬香型白酒釀造過程中篩選到的一株產異味突出放線菌株的次生代謝產物的研究表明，該菌種代謝所產土臭素是發酵醅中異味的主要來源，為關鍵特征性成分；同時，該菌還能抑制產醬香功能解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）產吡嗪類總量，對吡嗪代謝具有一定的調節作用。鹽霉素對釀造環境中芽孢桿菌等功能細菌和致病性雜菌具有明顯抑制作用，可抑制有害雜菌生長、調控醬香風味形成[45]。同時，尤小龍等[46]通過研究從醬香型白酒酒醅中分離出的2株放線菌的次生代謝產物生物學活性，發現2株放線菌均能代謝產生一種非蛋白類和非肽類抗生素來抑制產醬香的芽孢桿菌生長代謝，從而影響白酒風味物質形成和積累。

2.2 放線菌代謝產酶活性研究

醬香型白酒生產中所需酶類主要為蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等，蛋白酶類使蛋白質降解成氨基酸，促進微生物生長代謝；淀粉酶類水解淀粉成單糖，有利于微生物生長代謝和酒精生成；脂肪酶的水解產物經酯化反應可產一些白酒風味物質；纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解原料中纖維素、半纖維素和果膠等物質，促進淀粉降解[47-49]。近年來，通過對放線菌產酶活性研究表明，其雖沒有腐生葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和阿姆斯特丹散囊菌等其他細菌、真菌所產的酶活力高[4-5，15，18]，但也具有較高的酶活力，且由于放線菌是原核生物，結構簡單，易于基因改造和遺傳分析，在生產開發上還是有一定前景的。

高亦豹[21]研究發現高溫放線菌屬菌株Thermoactinomyces sanguinis能產多種酶并分解大分子物質，為微生物生長和風味物質合成提供前體物質。王芙蓉[24]從茅臺醬香型白酒酒廠的高溫大曲中篩選得到4株高溫放線菌，通過平板初篩和三角瓶復篩的方法，結果為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）產淀粉酶活力較高，其淀粉酶活力為815.54U/g干曲；未培養的高溫放線菌（uncultured Thermoactinomyces sp.）產纖維素酶的酶活力較高，其酶活力為87.13U/g干曲；糖高溫放線菌屬菌株Thermoactinomyces sacchari的產蛋白酶的活力最高，其酶活力為1 435.12U/g干曲。羅小葉等[27]對從醬香大曲中分離得到的3株放線菌進行產酶活性研究，結果表明3株菌產果膠酶能力較為突出，酶活分別為299.66U/g、216.52U/g、294.86U/g，部分高于細菌所產果膠酶最高酶活（259U/g）和霉菌所產果膠酶最高酶活（260U/g）；但3株菌產糖化酶、脂肪酶和纖維素酶等其他酶類的酶活相對較低。白成松等[31]從醬香型酒糟中篩選出一株耐高溫放線菌株，經鑒定為產色高溫單孢菌（Thermomonospora chromogena）。該菌株在55℃對淀粉、纖維素、蛋白質都具有較高的降解能力。于華等[50]從醬香型大曲中成功分離鑒定了一株高產蛋白酶的婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei），通過正交試驗，獲得該株菌最優產酶條件為培養溫度35℃，轉速180 r/min，培養基初始pH值為9。此最佳條件下其蛋白酶活力為28.62U/m L。

3 展望

目前，醬香型白酒釀造過程中放線菌的研究在分離鑒定、生物學功能對酒體品質和醬香風味形成等方面取得了一定成果，但相較于濃香型白酒中放線菌的研究還不夠全面及深入，很多機制問題還未解決。今后對醬香型白酒釀造中放線菌研究可從以下四個方面進行探索：

根據醬香型白酒生產工藝特點，建立快速有效的樣品采集及保存方法是醬香型白酒釀造中，對放線菌等微生物進行研究的基本要求。同時，經過醬香型白酒高溫制曲和高溫堆積工藝馴化，大量耐高溫放線菌株得以發現。準確、高效的樣品采集和保存方法的建立也有利于篩選功能型高溫放線菌，豐富已知醬香型白酒中放線菌的多樣性，為深入的功能性研究提供來源菌株。

第二，醬香型白酒生產地域性要求專一，地理氣候環境是決定酒品的關鍵因素之一，發酵過程中理化因素及環境條件在實驗室條件下較難模擬，限制了研究工作的開展。因地制宜，充分考慮溫度、濕度、原料、水源、空氣、曲房環境及發酵池環境等因素，開展醬香型白酒發酵條件模擬研究，保證研究結果的客觀性和準確性。

第三，傳統分離鑒定方法對于放線菌的分離鑒定效果不理想，在前期限制了放線菌的研究，隨著16S rDNA基因序列分析技術、聚合酶鏈式反應-變性梯度電泳技術（PCRDGGE）技術和高通量測序技術在微生物分離鑒定領域的廣泛應用，提高了放線菌分離鑒定效率，大量未培養放線菌在醬香型白酒釀造過程中被發現，豐富了放線菌多樣性；同時，頂空固態微萃取技術、氣相色譜-質譜聯用技術和液相色譜-質譜聯用技術被應用于放線菌次生代謝產物研究，為醬香型白酒釀造過程中放線菌的功能、活性成分及醬香風味形成分析提供了技術保障。

第四，細菌類群作為醬香型白酒生產中的生香動力來源，目前，對其研究主要集中在芽孢桿菌屬，對其中放線菌的研究還處于起步階段，重視程度不夠。隨著對放線菌次生代謝產物和功能性酶研究的深入，其對醬香型白酒發酵過程調節和風味物質形成的作用開始引起關注。加強醬香型白酒釀造過程中放線菌的研究，為進一步揭示醬香獨特風味形成機制指明了新的方向。