補(bǔ)脾益腎起痿湯對(duì)EAMG大鼠輔助性T細(xì)胞相關(guān)因子的影響

張運(yùn)克，劉沖沖

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

補(bǔ)脾益腎起痿湯是全國(guó)第三、四批名老中醫(yī)鄭紹周教授多年來治療重癥肌無力的經(jīng)驗(yàn)方，以補(bǔ)中益氣湯和二仙湯化裁而成，經(jīng)多年的臨床研究，對(duì)肌無力辨證為脾腎虧虛型的有效率達(dá)80%以上。為了探討本方治療肌無力的作用機(jī)理，我們通過采用人工合成免疫原制作實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型，采用抗原包被法測(cè)定大鼠血清AChR-Ab水平；應(yīng)用ELISA法檢測(cè)大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A和IFN-γ的濃度變化，初步探討補(bǔ)脾益腎起痿湯通過調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞相關(guān)因子治療MG的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康lewis雌性大鼠72只，年齡42～62天，體質(zhì)量150～160 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：11400700140544。河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為空白對(duì)照組、模型組、強(qiáng)的松對(duì)照組、補(bǔ)脾益腎起痿湯高中低3個(gè)劑量組共6個(gè)組，每組大鼠12只。

1.2 主要試劑和儀器

人工合成免疫原：人工合成鼠源性AChR-α亞基97～116肽段序列由上海淘普生物科技有限公司合成。規(guī)格：6 mg/支，分子量：2 252.62，純度：98.67%，序列號(hào)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐劑(CFA):購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,規(guī)格：10 mL/瓶，貨號(hào)：F-5881；不完全福氏佐(IFA)：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,規(guī)格：10 mL/瓶，貨號(hào)：F-5506；磷酸緩沖液(PBS)購(gòu)于Solarbio公司；大鼠/IL-6 、IFN-γ、IL-17A 、L-2 ELISA試劑盒購(gòu)于達(dá)科為公司；iMark酶標(biāo)儀購(gòu)自北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)脾益腎起痿湯由黨參20 g，仙靈脾15 g，黃芪50 g，升麻15 g，柴胡15 g，生白術(shù)15 g，陳皮10 g，當(dāng)歸15 g，炙甘草15 g，仙茅15 g組成，進(jìn)行濃煎后裝瓶備用，每毫升濃煎液含生藥0.74 g。

對(duì)照藥醋酸潑尼松片：H33021207，購(gòu)于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。

1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

方法參考許文華[1]免疫乳劑的制備：由R 97～116、CFA、PBS三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混勻制成；首次免疫:取乳劑200 μL(含100 μgR97～116)，于造模鼠背部多點(diǎn)、足墊皮下注射，對(duì)照組給予同等劑量的佐劑與PBS混合乳劑。第2次及第3次免疫：首次免疫后第30天及第45天,造模組每只大鼠含多肽100 μg,與100 μLPBS充分混合后加入100 μLIFA在混勻機(jī)上攪拌20 min后，最終制成油包乳液,再取乳劑200 μL(含100 μgR97～116)強(qiáng)化接種，對(duì)照組同樣注射等量PBS和佐劑，方法同首次免疫。

1.5 給藥方法

將60只EAMG大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只給予灌胃治療，其中模型組給予生理鹽水每日3 mL，補(bǔ)脾益腎起痿湯高、中、低濃度組分別按64.8 mg/(kg·d)、32.4 mg/(kg·d)、16.2 mg/(kg·d)給予實(shí)驗(yàn)藥物，西藥組給予醋酸潑尼松片5.4 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃4周。另外12只空白組大鼠給予生理鹽水每日3 mL。

1.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

1.6.1 組織液的制備

每組大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心15 min取血清，進(jìn)行分裝每管120 μL，-20℃保存?zhèn)溆谩８魅?.2 g脾臟、胸腺組織，分別加入0.3 mL生理鹽水，進(jìn)行勻漿，隨后再加入0.2 mL生理鹽水稀釋，吸取組織液，放入3 mLEP管內(nèi)，以轉(zhuǎn)速2 500 rpm，離心20 min，取出細(xì)胞上清液，分裝后放入-20℃冰箱。

1.6.2 大鼠血清中AChR-Ab濃度的測(cè)定

將血清提前放入4℃緩慢解凍10 h，觀察有無沉淀，如有快速離心1 min，采用抗原包被法測(cè)定血清AChR-Ab水平。方法如下：將R97-116(5 μg/mL)100 μL/孔包被96孔板，4℃過夜。棄用包被液洗板，取10 μL血清放入990 μL的PBS中稀釋，將每孔加入稀釋后血清100 μL/孔，設(shè)置空白孔，37℃溫浴30 min，期間取1 μL的辣根過氧化酶兔抗鼠IgG放入99 μL的PBS中稀釋，取稀釋好的液體20 μL放入3 980 μL的PBS繼續(xù)稀釋備用。溫浴時(shí)間到達(dá)后洗板，之后加入稀釋好的辣根過氧化酶兔抗鼠IgG 50 μL/孔37℃孵育30 min后洗板，加入底物和顯色劑(1∶1)混合液50 μL/孔溫浴10 min,再加入50 μL/孔2 mol/LH2SO4后采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度值。

1.6.3 大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的濃度的測(cè)定

采用ELISA法檢測(cè)大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的濃度，具體檢測(cè)方法按試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中AChR-Ab濃度

表1 各組大鼠血清中AChR-Ab 濃度(OD值)結(jié)果

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表1可以看出，模型組血清中AChR-Ab 濃度明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。西藥對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)藥物各劑量組均能夠降低模型組大鼠血清中AChR-Ab濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)藥物各劑量組與西藥對(duì)照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，但隨著藥物濃度的增高，降低的幅度逐漸增強(qiáng)。

2.2 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-2濃度比較

表2 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-2濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表2可以看出，模型組大鼠胸腺及脾臟組織中IL-2濃度較正常組相比明顯升高，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低組能夠降低模型組大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；與西藥對(duì)照組降低作用相比無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，降低IL-2濃度的幅度隨實(shí)驗(yàn)藥物的劑量增加逐漸增強(qiáng)。

2.3 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-6濃度對(duì)比

表3 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-6濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表3可以看出，模型組大鼠胸腺及脾臟組織中IL-6濃度較正常組相比明顯升高，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低組能夠降低模型組大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-6濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；與西藥對(duì)照組降低作用相比無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，降低IL-6濃度的幅度隨實(shí)驗(yàn)藥物的劑量增加逐漸增強(qiáng)。

2.4 各組胸腺、脾臟組織液中IL-17A濃度對(duì)比

表4 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-17A濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表4可以看出，模型組胸腺、脾臟組織液中IL-17A濃度明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。西藥對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)藥物各劑量組均能夠降低模型組大鼠胸腺、脾臟組織液組織液中IL-17A濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)藥物各劑量組與西藥對(duì)照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，但隨著藥物濃度的增高，降低的幅度逐漸增強(qiáng)。

2.5 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度比較

表5 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表5可以看出，模型組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度較正常組相比明顯升高，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低組能夠降低模型組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；與西藥對(duì)照組降低作用相比無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，降低大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度的幅度隨實(shí)驗(yàn)藥物的劑量增加逐漸增強(qiáng)。

3 討論

MG是具有細(xì)胞免疫依賴性,體液免疫介導(dǎo),補(bǔ)體參與,針對(duì)神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜上AchR的自身免疫性疾病[2]。輔助性T細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子影響MG的發(fā)病。其主要亞型包括Th1、 Th2 Th17等。Th1細(xì)胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)等，通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的相互作用影響免疫應(yīng)答,并輔助抗AchR抗體的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞及Th1細(xì)胞還直接損害NMJ及其AchR[3]。IL-2是參與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子之一，在MG的發(fā)病機(jī)制中起到促進(jìn)機(jī)體抗體的產(chǎn)生，加速T、B細(xì)胞活化、增殖、分化，使其活性增強(qiáng)，又可以通過增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的殺傷毒性而促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生一系列的炎性反應(yīng)[4]。INF-γ由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生，是一種促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生炎性作用的因子，是EAMG的中心效應(yīng)分子之一。INF-γ可以激活抗原提呈細(xì)胞，使其進(jìn)一步擴(kuò)增，活化AChR特異性T細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞的成熟，使其突觸后膜的乙酰膽堿抗體增加，從而引起NMJ的失調(diào)[5]。在MG發(fā)病過程中，INF-γ表現(xiàn)活躍，作為AChR-ab生成的必要因子，也作為驅(qū)動(dòng)因子,能加速INOS的活化，導(dǎo)致NO大量生成，參加細(xì)胞毒性作用，使EAMG大鼠NMJ處產(chǎn)生免疫損傷[6-7]。Th2細(xì)胞分泌IL-6等,與Th1相關(guān)的IFN-γ協(xié)同,輔助AchR特異性的B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗AchR抗體[8]。IL-6參與B細(xì)胞成熟分化成漿細(xì)胞，并通過IL-6R而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，是誘導(dǎo)免疫球蛋白產(chǎn)生的必需因子之一，能通過T細(xì)胞促進(jìn)IL-2表達(dá)，研究表明，在MG患者中，發(fā)現(xiàn)血清IL-6表達(dá)明顯高于正常人，隨著患者癥狀的減輕，血清亦IL-6水平下降[9]，IL-6在MG發(fā)病中起促進(jìn)作用[10]。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A等細(xì)胞因子[11]。IL-17是急性反應(yīng)性細(xì)胞因子，IL-17A是該家族的成員之一，能夠誘導(dǎo)促炎因子(如IL-6,TNF)以及趨化因子表達(dá)，使更多的免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位造成對(duì)機(jī)體的損害[12]。IL-17A對(duì)T細(xì)胞的活化起協(xié)同刺激作用，并能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，并在多種自身免疫性疾病中起到重要作用[13]。 IL-17A，參與自身免疫反應(yīng)、過敏反應(yīng)、腫瘤免疫以及對(duì)抗細(xì)菌和真菌感染的宿主防御反應(yīng)[14]。Mu 等[15]報(bào) 道 EAMG 存 在 Th1、Th2、Treg 及Th17 細(xì)胞比例的失調(diào)。由此可見，MG的發(fā)生并不是單一因素的參與，而是多種因素形成的瀑布鏈，共同導(dǎo)致MG的發(fā)病。

補(bǔ)脾益腎起痿湯由補(bǔ)中益氣湯合并二仙湯君藥組成，補(bǔ)中益氣湯作為補(bǔ)益脾胃的代表方，具有升提中氣的作用，對(duì)于“中氣下陷”的肌無力(痿證)具有明顯的臨床療效，符合“治痿獨(dú)取陽明”原則。徐鵬等[16]采用系統(tǒng)評(píng)價(jià)方法發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)益脾胃的中藥可調(diào)控免疫相關(guān)細(xì)胞因子如IL-4、 IL-6、 IFN-γ、 TGF-β、TNF-α的變化，改善自身免疫性重癥肌無力動(dòng)物癥狀。吳周燁等[17]報(bào)道：黃芪、柴胡、升麻、桔梗等升提藥物可以改善Rα97-116免疫Lewis大鼠構(gòu)建的EAMG模型臨床癥狀及體質(zhì)量下降趨勢(shì)，其機(jī)制可能是升高TGF-β含量，降低IFN-γ、IL-17含量。二仙湯君藥仙茅、仙靈脾具有補(bǔ)腎精、助腎陽的作用，和補(bǔ)中益氣湯合用適用于慢性緩解期重癥肌無力的作用，符合“補(bǔ)北”治療痿證的治則。張麗香等[18]報(bào)道：以補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合補(bǔ)腎藥物組成的溫腎健脾方對(duì)重癥肌無力患者增高的IL-6有明顯的降低作用。從本研究的結(jié)果來看，補(bǔ)脾益腎起痿湯通過降低人工合成免疫原制作實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ濃度，影響輔助性T細(xì)胞平衡，降低了血清AChR-Ab含量，起到拮抗炎癥反應(yīng)，減輕肌無力癥狀的作用。本研究從影響輔助性T細(xì)胞平衡的免疫作用方面，揭示了補(bǔ)脾益腎中藥復(fù)方治療重癥肌無力(痿證)的作用機(jī)理，為該類方藥的臨床應(yīng)用奠定藥理學(xué)基礎(chǔ)。