鐵在不同磷源條件下對銅綠微囊藻生長與產毒的影響

王 舉，陳 榮，陳 靜，沈 瑩

(西安建筑科技大學環境與市政工程學院，陜西西安 710055)

水體富營養化現象日益嚴重，已經成為全球面臨的水污染問題之一。水體富營養化過程中藍藻屬的微囊藻是最為常見的一種有害藻種[1]，其繁殖速度快、易在富營養化水體中大量生長且伴隨有藻毒素的產生危害人體健康。以往研究發現氮磷等營養物質超標是引發水體富營養化問題的重要原因[2]，然而在降低了氮磷濃度的自然水體中水華現象的爆發仍然屢見不鮮[3]。自然水體中磷主要以可溶性有機磷和懸浮態磷的形式存在，生物可直接利用的可溶性無機磷的含量很低，往往不能滿足藻細胞對磷的需求[4]。在湖泊藍藻水華形成的初期，可溶性無機磷含量往往不足，溶解性有機磷將會作為補充磷源，促進水華藍藻的生長[5-6]，因此藻類對有機磷的利用逐漸引起人們的關注[7-8]。隨著研究的深入，發現微量金屬元素也會成為藻類生長的關鍵影響因素[9]。鐵(Fe)作為藻類生長發育所必需的主要微量營養元素之一，在光合作用、呼吸作用、固氮作用、蛋白質與核酸合成等生理代謝過程的電子傳遞以及酶促反應中發揮著極為重要的作用[10-11]，同時鐵元素能夠影響藻毒素的形成。以往研究中以鐵元素單獨作用或者鐵與磷共同作用對藻類生長與產毒影響的研究較多[9]，而對有機磷與鐵共同作用的探討稍顯不足。本文探討微囊藻在不同磷源利用過程中鐵元素的作用特性，研究鐵與磷的共同作用對藻細胞生長與產毒的影響，為抑制藍藻暴發、解決水體富營養問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用藻種為產毒銅綠微囊藻 (Microcystis aeruginosa)，購置于中國科學院水生生物研究所，藻種編號為FACHB-912。采用BG-11培養基在恒溫光照培養箱中培養，培養溫度為(25±1)℃，光照為3000 lx，光暗時間分配為 12 h∶12 h。

實際水體中有機磷化合物的形態非常復雜，人們對其具體的組分和比例知之甚少[12]，通常認為堿性磷酸酶可以水解一些小分子有機磷和部分大分子有機磷，因此以小分子有機磷和大分子有機磷的研究較多[13-14]。本研究選擇3種具有代表性的磷：無機磷磷酸氫二鉀(K2HPO4)，小分子有機磷甘油磷酸鈉(C3H7Na2O6P·5．5H2O，簡寫為NaGly)和大分子有機磷卵磷脂(C40H82NO9P，簡寫為LEC)，試驗藥品均為國產科密歐分析純試劑。

1.2 培養基設置

培養基除氮、磷、鐵元素外，其他均依照BG-11的營養條件來設置。為保證培養基中各營養鹽濃度恒定，先按照BG-11培養基配方配置原液，然后按比例取一定體積原液混合后滅菌，再分別加入滅菌后的氮、磷、鐵配置液，最后用經過滅菌的超純水定容至500mL。由于再生水補水已經成為當前城市景觀水體補水的重要方式，因此氮濃度設置依據GB 18918—2002《城鎮污水處理廠污染物排放標準》中Ⅰ級A排放標準來設定(ρ(TN)≤15 mg/L)，試驗中以NaNO3為氮源設置硝氮質量濃度為10mg/L，分別以3種不同形態磷為磷源，總磷質量濃度設置為0．1 mg/L。鐵元素用檸檬酸鐵銨配置，在本研究對西安市城市景觀水體的調研中發現，其中微量元素鐵的質量濃度相對較高，從幾十至幾百μg/L，在實驗室研究中發現高磷條件下鐵最佳作用濃度范圍為500～1000 μg/L，設置 3 個濃度梯度，分別為50 μg/L、500 μg/L 和 1000 μg/L。

1.3 饑餓及接種

將正常培養至對數期的藻種在25℃、6000 r/min條件下離心10 min，去掉上清液后用15 mg/L的NaHCO3洗滌3次后保留離心得到的藻細胞，接種至饑餓處理的培養基(不含氮、磷、鐵元素)預培養7 d。預培養結束后按上述方法再次離心只留下藻細胞后，接入配置不同鐵濃度梯度培養基中，接種初始藻密度約為2×105個/mL，初始培養時培養液總體積為500 mL，培養瓶是總容積為1000 mL的廣口錐形瓶。接種好的培養瓶置于設置好的培養箱中培養，為確保試驗準確，每個樣品設3個平行樣，每天手動搖3～4次，并將各培養瓶隨機放置，以減少光強對藻類生長的影響。

1.4 指標測定

1．4．1 藻密度、藻細胞平均粒徑及增長率

藻密度及藻細胞平均粒徑的測定采用細胞計數分析儀(Cellometer Auto T4，達科為，中國)，每次測定取樣量為1 mL。試驗過程中，從接種至結束每隔1 d測定1次藻密度。藻細胞比增長率計算公式為

式中：Xt為某一時間間隔終結時的藻細胞數量;X0為某一時間間隔開始時的藻細胞數量;t為時間間隔。當連續2 d的μ小于5%時即認為藻細胞停止生長。

1．4．2 葉綠素 a 的測定

葉綠素a的測定采用乙醇提取法，每2d測定一次，每次取10 mL藻液。將取出的藻液加入適量飽和碳酸鎂混勻后經真空抽濾裝置抽濾，將濾紙用剪刀剪碎后加入5 mL體積分數為90%的乙醇，置于4℃冰箱中，黑暗提取8～12 h，離心后取上清液經分光光度計測定。

1．4．3 藻細胞中溶解性總磷濃度

取一定量的藻液，6000 r/min離心10 min，棄上清液留下藻細胞加入5 mL超純水，經5%過硫酸鉀消解后，以抗壞血酸為還原劑采用磷鉬藍比色法進行測定。

1．4．4 堿性磷酸酶活性

堿性磷酸酶活性(alkalinephosphatase activity，APA)與水體富營養化程度呈正相關，當溶解性無機磷含量很低時堿性磷酸酶才會被激活，高濃度的溶解性無機磷對APA幾乎無影響，因此APA的檢測有助于分析藻細胞對磷源的吸收轉化狀況[15-16]。

取5 mL藻樣，加入已經滅菌的比色管中，隨后加入1mL Tris-HCl緩沖液(pH值8．5)，搖勻后加入1 mL反應底物對硝基苯磷酸二鈉(p-Nitrophenyl phosphate，PNP-P)。將比色管避光處理放在30℃的生化培養箱中，反應6 h，用1 mL的0．5 mol/L的NaOH溶液來終止反應。用紫外分光光度計在410 nm處測定反應產物對硝基苯酚(p-Nitrophenol，PNP)的產生量，并計算單位時間所產生的PNP，并以此作為細胞APA的單位。

1．4．5 胞內藻毒素(MC-LR)

標準藻毒素樣品(純度98%)購置于Sigma，按GB/T 20466—2006《水中微囊藻毒素的測定》中藻毒素的測定方法測定，采用液相色譜裝置測定(LC-2000，日立，日本)藻毒素含量，分離柱尺寸為250 mm ×4．6 mm(SB-C18，安捷倫，美國)。 從培養第2天開始每隔1天測定一次藻細胞藻毒素含量，第2天藻液取樣量為15 mL，以后每次為10 mL，樣品的制備參考Long[17]的制備方法。

1.5 數據分析

所有試驗數據均采用Excel 2010處理，采用Origin9．1繪圖，數據統計分析采用 SPSS20．0，P 值表明各組數據之間是否存在顯著性差異，P＜0．05有顯著性差異，P＞0．05無顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 藻細胞生長狀況

2．1．1 不同磷源對藻細胞生長的影響

圖1～3為不同磷源條件下銅綠微囊藻的細胞密度、葉綠素a質量濃度和細胞平均粒徑變化情況。由圖1～3可以看出，以K2HPO4與NaGly為磷源時，藻細胞生物量間并無顯著性差異，而以LEC為磷源時存在顯著性差異(P＜0．05)。以K2HPO4為磷源時藻細胞的平均粒徑變化較為平緩，波動性不大;以NaGly為磷源時藻細胞平均粒徑有較小波動;而以LEC為磷源時藻細胞的平均粒徑波動性較大。即在K2HPO4與NaGly為磷源的條件下藻細胞的生存狀態更為穩定，磷源越容易被利用越有利于藻細胞的生長。以K2HPO4與NaGly為磷源時，在培養期間藻細胞數量都在不斷增加，最大藻細胞數量分別可達到6．02 ×106個/mL 和 6．43 ×106個/mL，而以 LEC為磷源時，在整個培養期間藻細胞數量只有少量增長。以往研究中發現正磷酸鹽是最易吸收和利用的一種磷源，而小分子有機磷和大分子有機磷都需經過諸如堿性磷酸酶等水解轉化為磷酸鹽后方可被利用，并且小分子有機磷比大分子有機磷更容易轉化為磷酸鹽。但本研究發現K2HPO4與NaGly對藻細胞生長的作用并無顯著性差異，而只與LEC之間存在顯著性差異，即藻類在吸收磷時，藻細胞對K2HPO4和NaGly的利用效率較高，而對LEC的利用率較低。從圖2葉綠素a濃度的變化趨勢可以看出，在以K2HPO4與NaGly為磷源時，葉綠素a質量濃度與藻細胞生物量的變化趨勢基本一致，經相關性分析發現二者之間顯著相關，而在以LEC為磷源時葉綠素a質量濃度與藻細胞生物量間相關性較差。

圖1 不同磷源下銅綠微囊藻細胞密度

圖2 不同磷源下銅綠微囊藻葉綠素a質量濃度

圖3 不同磷源下銅綠微囊藻細胞平均粒徑

K2HPO4與NaGly對藻細胞生長(藻細胞數量與葉綠素a濃度)的影響并無顯著性差異，其主要原因可能與微量元素鐵相關，K2HPO4可以被藻細胞直接吸收利用，而微量元素鐵促進了NaGly的吸收，使其更有利于藻細胞的生長。微量元素鐵對LEC雖也有促進作用，但由于LEC較難被水解，因此促進效果并沒有對NaGly的作用顯著。以K2HPO4為磷源時，不同含量的鐵對藻細胞生長的影響不同，隨著鐵含量的增加藻細胞數量呈現降低的趨勢。在試驗過程中發現，K2HPO4為磷源的培養液中有顆粒狀物質(磷酸鐵沉淀)出現，鐵含量越高產生的沉淀就越多，藻細胞可利用的磷源就越少，藻細胞的生長受到限制;低鐵條件下，藻細胞可利用的磷源相對較多，鐵含量相對較少，有利于藻細胞的生長。在試驗中還發現，隨著試驗的進行磷酸鐵沉淀在逐漸減少，其原因可能是隨著試驗的進行，培養液中藻細胞可直接利用的磷酸鹽含量逐漸減少，當磷酸鹽含量降低到一定量之后，磷酸鐵沉淀作為磷源逐漸被藻細胞吸收利用。當有機磷作為磷源時未觀察到沉淀產生，由于藻細胞會將有機磷吸附到細胞表面，水解產生的磷酸鹽含量較少，可以被藻細胞直接吸收利用。在以NaGly為磷源時，低濃度的鐵顯著促進了藻細胞的生長，高濃度的鐵對藻細胞數量的影響差異性不大，即高鐵濃度也會抑制藻細胞的生長但抑制效果較弱。

2．1．2 不同鐵濃度對藻細胞生長的影響

圖4為不同磷源下藻細胞比增長速率與鐵濃度關系。由圖4可以看出，藻細胞在K2HPO4與NaGly為磷源的條件下細胞比增長速率較大，且二者的比增長速率并無顯著性差異，在LEC為磷源的條件下比增長速率較小。在同一磷源條件下，微量元素鐵對藻細胞比增長速率的影響并無顯著性差異，都是隨著鐵濃度的減少，藻細胞的比增長速率逐漸增加，即在高氮低磷的條件下較低濃度的鐵即可滿足藻細胞生長的需求，而過高的鐵濃度則會對藻細胞的生長產生抑制作用。其抑制作用的原因可能是因為藻細胞壁帶有負電荷和一些含硫、氮和氧的官能團，它們較易與陽離子發生電荷吸引和進行螯合反應，使重金屬沉積在藻細胞表面并通過細胞的生理過程轉移到細胞內部，從而抑制藻類的光合作用、呼吸作用、酶的活性和生長[18-19]。另外，Fe3+與磷酸鹽易產生沉淀也是限制藻細胞生長的原因之一。

圖4 不同磷源下藻細胞比增長速率與鐵濃度關系

2.2 藻細胞胞內總磷及APA的變化

圖5 不同磷源下胞內總磷質量濃度及APA變化

圖5 為不同磷源下胞內總磷濃度及APA變化。由圖5可見，以K2HPO4為磷源時，藻液中總的APA在不斷增加，不同的鐵質量濃度對總的APA影響較大，鐵質量濃度越低藻液中總的APA越多，不同鐵質量濃度下藻細胞中的胞內總磷逐漸增加趨于穩定，鐵質量濃度越低越有利于胞內總磷的累積。以NaGly為磷源時，藻液中總的APA也在不斷增加，其中ρ(Fe)為50μg/L時總APA最高，ρ(Fe)為 1000μg/L產生的APA高于ρ(Fe)為500 μg/L條件下產生的APA，藻細胞中胞內總磷呈現出先增大后減少的趨勢，不同鐵濃度下藻細胞胞內總磷的變化也有所差異，ρ(Fe)為50 μg/L時藻細胞胞內總磷的變化趨勢最為顯著，其次是ρ(Fe)為1000 μg/L時。以LEC為磷源時藻液中總的APA波動性較大，不同的鐵濃度未對APA產生顯著性差異，藻細胞中的總磷呈現逐漸增加的趨勢但增幅較小，不同的鐵濃度對藻細胞中胞內總磷的影響較小。堿性磷酸酶屬于胞外酶，其主要功能是從外界向細胞提供磷源，在細胞內磷源相對充足時酶的活性比較低。研究[20]顯示，藍藻在大分子有機磷作為磷源的情況下，培養基中的APA會迅速提高，而本研究中發現在LEC的培養條件下藻液中的APA較低，而在K2HPO4與NaGly培養條件下的APA在逐漸增多且增幅較大，但兩者的APA并未出現顯著性差異。APA與磷營養水平之間呈明顯的負相關關系，這種關系常被稱作“抑制-誘導機制”[21-22]，而本研究未發現胞內總磷與APA的相關性，其主要原因可能與鐵和磷的共同作用有關。

2.3 藻細胞產毒狀況

2．3．1 培養過程中藻毒素產量

本研究所用的銅綠微囊藻在生長過程中主要產生3種藻毒素異構體：MC-RR、MC-YR和MC-LR。在試驗過程中發現MC-RR和MC-YR濃度非常低，幾乎檢測不到，我國GB 3838—2002《地表水環境質量標準》中規定MC-LR濃度限定值為0．001 mg/L，因此主要研究MC-LR在藻細胞生長過程中的變化。

圖6為不同磷源下銅綠微囊藻毒素濃度。由圖6可見，藻毒素濃度在3種不同磷源條件下培養過程中呈現出先增加后減少的趨勢。以K2HPO4為磷源時，微量元素鐵對藻毒素產生了顯著性差異，其中 ρ(Fe)為500 μg/L 與 ρ(Fe)為50 μg/L 時藻毒素濃度相接近，ρ(Fe)為1000μg/L時藻毒素濃度顯著偏低。 以 NaGly為磷源時，ρ(Fe)為1 000 μg/L與ρ(Fe)為500 μg/L時產生的藻毒素濃度相接近，而ρ(Fe)為50 μg/L時的藻毒素濃度顯著高于其他濃度。以LEC為磷源時，不同鐵濃度條件下藻毒素濃度的變化差異性較大，ρ(Fe)為50 μg/L時藻毒素濃度最高但波動性較大，ρ(Fe)為500 μg/L時藻毒素濃度較低但在持續增加，ρ(Fe)為1000μg/L時藻毒素濃度較低呈現出先增長后降低的趨勢。以往研究發現一定的鐵濃度有利于藻毒素的產生，而過高或過低的鐵濃度都會對藻毒素產生抑制作用[23]，而本研究與此有所差異，其原因可能與磷源類型以及磷的質量濃度有關。

2．3．2 不同磷源條件下葉綠素a與胞內藻毒素的相關性

表1為藻細胞葉綠素a與胞內藻毒素(MCLR)相關性分析結果。由表1可見，不同磷源與不同鐵濃度條件下，藻細胞在對數增長期(藻細胞比增長率大于5%的階段)時葉綠素a質量濃度與胞內藻毒素(MC-LR)呈現正相關關系且相關性較高，這與以往的研究結果相一致[24]。但當藻細胞比增長率小于5%時，葉綠素a的濃度雖還有少量增加但藻毒素濃度卻已經減少，即藻細胞產生藻毒素的衰減過程要早于藻細胞中葉綠素a的衰減過程。

圖6 不同磷源下銅綠微囊藻毒素質量濃度

表1 藻細胞葉綠素a與胞內藻毒素(MC-LR)相關性分析

2．3．3 不同磷源條件下的特定產毒量

藻細胞的特定產毒量是評價藻細胞在生長過程中生成藻毒素的一個重要指標，它能更直觀地反映出環境因素對于藻細胞產毒的影響。圖7為不同磷源下藻細胞特定產毒量，可以看出，K2HPO4與NaGly更有利于藻毒素的生成。以K2HPO4為磷源時，微量元素鐵對藻毒素的生成產生了顯著影響，ρ(Fe)為500 μg/L時最有利于藻毒素的產生，此時藻細胞的數量也較高，因此總的藻毒素濃度較高。ρ(Fe)為1000μg/L時，藻細胞產生的藻毒素濃度最少，與LEC中藻細胞產毒量相接近，此時藻細胞數量最低，因此總的藻毒素含量也最低。ρ(Fe)為50 μg/L時，藻細胞產毒量較高與NaGly中藻細胞產毒量相接近，但由于藻細胞數量較高，因此總的產毒量較高。以NaGly為磷源時，不同鐵濃度下的藻細胞產毒量相接近，其中ρ(Fe)為500 μg/L時藻細胞產毒量最低，ρ(Fe)為50 μg/L時藻細胞產毒量最高，此時藻細胞數量也最高，因此總的藻毒素含量最高，甚至超過了K2HPO4為磷源條件下的藻毒素含量。以LEC為磷源時，隨著鐵濃度的降低藻細胞中藻毒素濃度卻在增加，即低鐵濃度條件下更有利于藻毒素的產生。總的來說，以K2HPO4為磷源時，不同濃度的鐵對藻細胞產毒量影響的差異性較大，即鐵元素在其中發揮著重要作用;以NaGly為磷源時，藻細胞產毒量較高，不同濃度的鐵對其影響較弱;以LEC為磷源時，藻細胞產毒量最低，不同的鐵濃度對其產毒量影響較大，低鐵濃度條件下更有利于藻毒素的產生。

圖7 不同磷源下藻細胞特定產毒量

3 結 論

a.K2HPO4與NaGly對藻細胞生長的促進作用顯著，K2HPO4條件下高濃度的鐵會顯著限制藻細胞的生長。

b. 以 K2HPO4為磷源時，ρ(Fe)為 500 μg/L 時最有利于單細胞的產毒;以NaGly為磷源時，單細胞的產毒量較大，不同鐵濃度間的產毒量差異性不大;以LEC為磷源時，單細胞的產毒量最少，但低濃度鐵有利于單細胞的產毒。

c.在對數增長期的培養階段，藻細胞中的葉綠素a與胞內藻毒素呈現較強的線性相關性。

d.在不同磷源與微量元素鐵的條件下，藻細胞胞內總磷與APA并未出現相關性。

e.NaGly與鐵的共同作用對藻細胞生長與產毒的影響，在一定條件下比K2HPO4與鐵對藻細胞生長與產毒的影響更為顯著。因此，對以小分子有機磷為主要磷源水體的富營養化應更多關注微量元素鐵對其的影響。