高良姜中高良姜素提取純化工藝研究

蘭 月，黃利豪，劉 鵬，陳旅翼

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

1 引言

高良姜?jiǎng)e名蜜姜、南姜、小良姜等，是姜科山姜屬植物(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖。全國(guó)野生高良姜的主產(chǎn)地分布在廣東、廣西、海南和云南等地。高良姜性熱味辛，主要有溫胃散寒，消食止痛的功效，是治療脘腹冷痛，胃寒嘔吐，噯氣吞酸等癥狀的良好藥材[1]。高良姜主要化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、糖苷類(lèi)、苯丙素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、二芳基庚烷類(lèi)。而黃酮類(lèi)成分主要有高良姜素、山柰素、山柰酚、槲皮素、異鼠李素等[2]。本文探索了高良姜中高良姜素的提取純化條件，為高良姜的進(jìn)一步藥理學(xué)研究提供材料，也為山姜屬植物的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)拓思路。

2 儀器與試劑

2.1 材料

高良姜藥材購(gòu)于安國(guó)市盛輝中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣東湛江，由中南民族大學(xué)陳旅翼副教授鑒定為高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的根。

2.2 標(biāo)樣與試劑

高良姜素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇(TEDIA COMPANY，INC)為色譜純；其余試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。AB-8大孔吸附樹(shù)脂：上海摩速科學(xué)器材有限公司；聚酰胺樹(shù)脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。色譜柱(250×4.6mm， Agilent 5 TC-C18)。

2.3 儀器

高效液相色譜儀(UltiMate3000，美國(guó)戴安公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-1，上海亞榮生化儀器廠)；水浴鍋(B-260，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(JY1002，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)2015年版中國(guó)藥典規(guī)定，設(shè)置色譜條件：流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm，以乙腈-0.2%磷酸溶液(55∶45)為流動(dòng)相，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣20 min[3]。

精密稱(chēng)取高良姜素對(duì)照品0.0040 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，濃度為40 μg/mL，分別依次進(jìn)樣1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL。按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 高良姜素得率和含量的測(cè)定方法

將供試品過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，轉(zhuǎn)入液相小瓶備用。按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”項(xiàng)下進(jìn)行操作，測(cè)定峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算被測(cè)樣品中高良姜素含量。

得率=提取物質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%

3.3 提取條件單因素試驗(yàn)

選取藥材提取的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等4個(gè)可能影響提取效果的因素做單因素實(shí)驗(yàn)，以確定相關(guān)因素及各因素的合適范圍。

3.4 提取條件正交試驗(yàn)

運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化提取工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等4個(gè)影響較大的因素進(jìn)行優(yōu)化組合，考察指標(biāo)為高良姜素得率和含量，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平

3.5 大孔吸附樹(shù)脂純化

大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)主要應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的分離與純化的有機(jī)高聚物吸附劑[4]。大孔吸附樹(shù)脂具有穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨(dú)特、富集效果好、解吸條件溫和、不受無(wú)機(jī)物影響、再生簡(jiǎn)便、使用周期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[5]。本試驗(yàn)選用AB-8大孔樹(shù)脂聯(lián)合聚酰胺樹(shù)脂對(duì)高良姜素進(jìn)行純化。

4 結(jié)果與討論

4.1 工作曲線及線性方程

用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=86.292X+0.1903，R2=1。高良姜素進(jìn)樣量在0.04 μg～0.8 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 高良姜素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

4.2 提取條件單因素試驗(yàn)

4.2.1 乙醇濃度對(duì)高良姜素得率和含量的影響

固定料液比1∶10(g/mL)，提取時(shí)間2 h，提取溫度90 ℃、提取次數(shù)1次，考察不同乙醇濃度80%、85%、90%、95%，對(duì)高良姜素含量和得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著乙醇濃度的增加，高良姜素得率和含量隨之增大。當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，得率和含量皆有所下降。因?yàn)橐掖紳舛容^低時(shí)，提取液中蛋白質(zhì)，糖類(lèi)等水溶性物質(zhì)大量溶出，雜質(zhì)含量較高，而醇濃度過(guò)高，脂溶性的物質(zhì)溶出也增多，影響高良姜素的溶出。

4.2.2 料液比對(duì)高良姜素得率和含量的影響

固定乙醇濃度90%，提取時(shí)間2 h，提取溫度90 ℃、提取次數(shù)1次，考察不同料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)，對(duì)高良姜素含量和得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。不同料液比對(duì)高良姜素含量的變化影響較小，增幅在14.40%左右。料液比在1∶6～1∶12時(shí)，得率隨料液比增大而增大，而料液比為1∶10時(shí)得率降低。當(dāng)料液比較小時(shí)，溶劑用量的增加會(huì)使傳質(zhì)力加快，有利于高良姜素的提取。從浸提效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面考慮，料液比為1∶8比較合適[6]。

圖1 乙醇濃度對(duì)高良姜素得率和含量的影響

圖2 料液比對(duì)高良姜素含量和得率的影響

4.2.3 提取時(shí)間對(duì)高良姜素得率和含量的影響

固定乙醇濃度90%，料液比1∶8，提取溫度90 ℃、提取次數(shù)1次，考察不同提取時(shí)間1、1.5、2、2.5、3 h，對(duì)高良姜素含量和得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。高良姜素含量隨著時(shí)間的增大而緩慢增大，而高良姜素含量在3 h時(shí)明顯下降。高良姜素得率隨著時(shí)間的增加而降低，而在1.5 h時(shí)達(dá)到峰值，這是因?yàn)闀r(shí)間的增大可以使高良姜素最大限度地溶出，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使高良姜中其它成分溶出，降低了高良姜素的含量，而且周期延長(zhǎng)不利于生產(chǎn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)高良姜素含量和得率的影響

4.2.4 提取溫度對(duì)高良姜素得率和含量的影響

固定乙醇濃度90%，料液比1∶8、提取時(shí)間2.5 h、提取次數(shù)1次，考察不同提取溫度60、70、80、90、100 ℃，對(duì)高良姜素含量和得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著溫度的升高，高良姜素的得率增大，而在80℃以后，得率減小。高良姜素含量會(huì)隨著溫度的升高而降低。因?yàn)闇囟鹊纳邥?huì)使高良姜素在乙醇中中的溶解度增大，而溫度過(guò)高，使得高良姜素遭到破壞。此外，溫度過(guò)高，會(huì)使得雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)的分離提純操作帶來(lái)不便。所以溫度在60～70 ℃的范圍內(nèi)比較合適。

圖4 提取溫度對(duì)高良姜素含量和得率的影響

4.3 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，各因素對(duì)高良姜素綜合值影響的主次順序?yàn)椋禾崛囟?料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間。確定最佳提取條件為A2B1C1D3，即乙醇濃度90%、料液比1∶6(g/mL)、提取時(shí)間1 h、提取溫度80 ℃。

對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，選取最優(yōu)組合平行三次試驗(yàn)，得出平均綜合值為2.00，證明采用此工藝提取高良姜酚酸合理、可行、穩(wěn)定。

綜合值=含量/最高含量(5.21%)+得率/最高得率(79.46%)。

4.4 大孔樹(shù)脂純化結(jié)果

按照上述試驗(yàn)優(yōu)選出的條件進(jìn)行高良姜素的提取，抽濾，旋蒸濃縮至無(wú)醇味，加入原液1/2體積的40%乙醇溶解，即得上樣液。先用AB-8型大孔樹(shù)脂柱吸附，得到高良姜素純度為21.80%。再用聚酰胺樹(shù)脂柱吸附，所得高良姜素的純度為45.77%。洗脫方法皆為：用蒸餾水、30%乙醇除雜，再用50%、70%、95%的乙醇梯度洗脫，合并組分得到高良姜素。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

5 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)確定了高良姜素的最佳提取工藝為原料重6倍的90%乙醇為溶劑，在80℃下提取1h，該工藝的得率可達(dá)到81.59%，含量可達(dá)到6.38%。AB-8大孔樹(shù)脂和聚酰胺樹(shù)脂聯(lián)用進(jìn)行純化后，所得高良姜素的純度為45.77%。