核桃不同單株種子化學成分傅立葉紅外光譜差異性分析

楊靜怡，夏玉芳，謝釗俊，陶興月，丁小霞

（貴州大學 林學院，貴州 貴陽550025）

核桃不同單株種子化學成分傅立葉紅外光譜差異性分析

楊靜怡，夏玉芳，謝釗俊，陶興月，丁小霞

（貴州大學 林學院，貴州 貴陽550025）

為了探索一種高效快速安全的測量核桃Juglans regia內含化學物質的方法，采用紅外光譜法研究了分別采自貴州省赫章縣和普定縣的11個核桃單株種子化學成分的紅外光譜，根據與蛋白質、脂肪、碳水化合物實測含量值相關度較高的吸光值比D（1658）/D（3010），D（1747）/D（3010）和D（1100）/D（3010），對核桃種子蛋白質、脂肪和碳水化合物的相對含量進行了比較分析，并利用其紅外光譜吸收峰值對11個核桃單株進行聚類分析。結果表明：以上特征峰值與用經典化學分析法測得的核桃化學成分含量值的相關系數均高于顯著性水平為0.01的臨界值，即可認為它們是極顯著相關的。因此，傅立葉紅外光譜法適宜作為一種快速高效直接的測定核桃種子物質成分組成和相對含量的方法。研究結果可在一定程度上為核桃的良種選育和親緣關系確定提供理論依據。圖2表4參16

經濟林學；核桃；紅外光譜；方差分析；聚類分析

核桃Juglans regia是一種優良的干果經濟樹種，其種子具有極高的營養價值。中國核桃的分布范圍很廣，遼寧、北京、山東、安徽、湖南、廣西、云南、貴州等21個省區均有分布［1］。核桃種子的品質除了種子的大小、質量、形狀、種殼厚度、出仁率和風味等形態和感官指標外，還取決于粗脂肪、蛋白質和碳水化合物等營養內含物［2］。因此，僅從核桃種子的外觀形態上來判斷其品質難以鑒別其優劣，還須測定其內含物的狀況。傳統的核桃種子內含物的測定主要采用化學分析的方法，需要繁雜的分離和提取過程［3－5］，操作復雜，需樣量大，耗時較長，且誤差較大。近年來也有運用近紅外光譜法測定核桃的脂肪、蛋白質等營養物質含量［6－7］，但近紅外檢測法技術難度很大，需要選取代表性強的樣品（即含量要具有梯度），并且選擇適宜的擬合方法，才能夠建立起適應性較強的數學模型，不易進行推廣。傅立葉紅外光譜法（FTIR法）可快速宏觀地對樣品整體進行多組分檢測，需樣量小，無需分析提取，安全無毒害，且誤差較小。正是由于FTIR法高效、安全的特點，現已廣泛應用于藥品、食品和木材的質量檢測［8－9］。本研究利用傅立葉變換紅外光譜儀對分別采自貴州省赫章縣和普定縣11個單株的核桃種子化學成分進行了測定分析，以期為貴州省核桃的良種選育和品種改良提供參考依據。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗儀器與試劑

SZF-06A脂肪測定儀；紫外可見分光光度計；Perkin-Elmer公司 Fontier傅立葉變換紅外光譜儀（含spectrum分析軟件）；山海山岳YP-2壓片機（含13 mm壓片模具和瑪瑙研缽）；0.1 mg精度的電子天平；考馬斯亮藍；乙醚；蒽酮試劑；光譜純溴化鉀粉末。

1.2 試驗材料

2012年11月，分別在貴州省赫章縣和普定縣選取11株生長良好果實飽滿的壯齡期單株作為母樹并對其進行編號。其中采自赫章縣的9個單株核桃種子編號為赫1~赫9，赫5與赫9為鐵核桃；采自普定縣的2個單株核桃種子編號為普1，普2。采收后去青，并在自然條件下風干。

1.3 樣品的準備

隨機選擇外觀飽滿，無破損核桃種子10粒·株－1，去殼后分為2組，5粒·組－1。一組剝去內種皮后粉碎為細粒狀，用于蛋白質、脂肪、糖含量的測定；另一組剝去內種皮后研磨成泥狀。準確稱取1.0 mg研磨后樣品與200.0 mg溴化鉀粉末混合（即混合比例為1∶200），繼續在瑪瑙研缽中將混合物研磨均勻后用壓片機壓制成片，至少平行重復做2次·粒－1。

1.4 化學物質的測定［10］

核桃種子蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法，考馬斯亮藍與樣品中蛋白質反應后產生有色物質，在紫外分光光度計中測定反應物的光密度即可求出蛋白質的含量。

核桃種子的粗脂肪含量采用索氏抽提法，種子中的脂類物質溶于有機溶劑乙醚中，對樣品進行循環抽提，對抽提的粗脂肪稱量即可獲得粗脂肪的含量。

核桃種子可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，樣品與濃硫酸反應后脫水形成糖醛，再與蒽酮縮合形成有色物質，在紫外分光光度計中測定反應物的光密度即可求出碳水化合物的含量。

1.5 光譜測定

將Fontier傅立葉變換紅外光譜儀分辨率設為4 cm－1，掃描次數設為20，光譜測量范圍為4 000~400 cm－1。掃描后的原始光譜圖在Spectrum分析軟件中進行基線校正和歸一化（標準化）處理，即將光譜的最大吸收峰擴展/縮小至3.0，將基線移至0處。這樣處理能夠美化曲線，利于光譜解析，且標準化后的不同種子光譜曲線峰值全部統一在同一個范圍內，有助于物質相對含量的差異性分析。

1.6 數據分析方法

計算核桃種子化學物質的特征峰值與實測值的相關系數r，并通過相關系數臨界值表查得顯著性水平為0.010，自由度為9的相關系數臨界值為0.735，超過該臨界值，即認為與核桃種子化學成分的特征峰值與實測值極顯著相關。

11個核桃單株的差異性分析采用單因素方差分析及Student-Newman-Keul（SNK）多重比較。

利用蛋白質、脂肪和碳水化合物的特征峰值對11個核桃單株進行聚類分析，采用最短距離系統聚類法，聚類距離為歐氏距離的平方。

以上數據分析方法均在SPSS 19.0軟件中實現。

2 結果與分析

2.1 核桃樣品的紅外光譜分析

紅外光譜曲線是通過峰位和峰值來確定樣品內含物的種類和相對含量的。不同光波上出現峰值代表不同化合物，而相同波數上峰值大小的不同則代表著相對含量的不同。

如圖1所示：核桃的紅外光譜在2 926，2 855和1 747 cm－1處有強吸收峰。這3個峰均為油脂的特征峰，2 926 cm－1處為CH2的不對稱伸縮振動的吸收峰，2 855 cm－1處為CH2的對稱伸縮振動的吸收峰，1 746 cm－1處為碳氧雙鍵伸縮振動的吸收峰［11］。此外，核桃的紅外光譜還在 1 658，1 548，1 465，1 378，1 239，1 163和1 100 cm－1處有中等吸收峰。其中，1 465，1 378和1 163 cm－1處仍為油脂的吸收峰，1 465 cm－1處是CH2和CH3的不對稱變形振動吸收峰，1 378 cm－1處是CH3的對稱彎曲振動吸收峰，1 163 cm－1處是酯基的C—O伸縮振動吸收峰［12］。1 658，1 548和1 239 cm-－1處為蛋白質的吸收峰，1 658 cm－1處為酰胺Ⅰ帶碳氧雙鍵吸收峰，1 548 cm－1處為酰胺Ⅱ帶的N－H和C×N吸收峰，1 239 cm－1處為酰胺Ⅲ帶碳氧伸縮振動吸收峰［13］。1 100 cm－1處是碳氧伸縮振動與環的振動，為碳水化合物（糖類）的吸收峰［13］。

圖1 核桃的紅外光譜圖Figure 1 FTIR spectrum of walnut

2.2 核桃不同單株種子化學成分特征峰值分析

表1中列出了11株核桃在1 658，1 548和1 239 cm－1處的平均峰值，分別代表了蛋白質酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶的吸收峰。由于蛋白質中酰胺Ⅰ帶特征性強，且附近沒有其他峰的干擾［10］，因此，可將D（1658）作為核桃蛋白質的分析峰。本研究選取D（3010）作為參比峰， D（1658）/D（3010）比值與蛋白質含量實測值的相關系數為0.914，大于臨界值0.735，因此，該值可用于不同單株核桃種子蛋白質含量的差異性分析。

表1 核桃蛋白質特征峰值Table 1 Characteristic absorption peak of protein in walnut samples

表2中列出了11株核桃在 2 926， 2 855， 1 747，1 465，1 378和 1 163 cm-1處的平均峰值，分別代表了油脂CH2的不對稱和對稱伸縮振動的吸收峰，碳氧雙鍵伸縮振動吸收峰，CH2和CH3的不對稱變形振動吸收峰，CH3的對稱彎曲振動吸收峰和酯基的C—O伸縮振動吸收峰。其中，1 747 cm－1處的碳氧雙鍵伸縮振動吸收峰與脂肪含量的線性關系最好［12］，D（1747）/D（3010）比值與粗脂肪含量實測值的相關系數為0.940，大于臨界值0.735，因此，該值可用于不同單株核桃種子脂肪含量的差異性分析。

表3中列出了11株核桃在1 100 cm－1處的平均峰值，代表了碳氧伸縮振動與環的振動，是碳水化合物的特征峰（包括可溶性糖、纖維素、淀粉等），因此，該峰值可在一定程度上反映可溶性糖的變化。D（1100）/D（3010）比值與可溶性糖含量實測值的相關系數為0.786，大于臨界值0.735，因此，該值可用于不同單株核桃種子碳水化合物含量的差異性分析。

表2 核桃脂類含量的特征峰值Table 2 Characteristic absorption peak of fat in walnut samples

2.3 核桃不同單株種子化學成分特征峰值的差異性分析

通過對11株核桃化學物質特征峰值的方差分析發現，11株核桃的蛋白質、脂肪和碳水化合物含量均存在著極顯著差異，因此，進一步用SNK多重比較法進行多重比較。表4表明：赫3，赫4，赫5，赫7，赫8的蛋白質含量的差異不顯著，赫1，赫2，赫6，赫9的蛋白質含量差異也不顯著。而采自普定的普1和普2號核桃種子蛋白質含量顯著低于其余采自赫章的核桃種子。其中，普2號核桃種子蛋白質含量極顯著低于其他的核桃種子。普2號核桃種子的脂肪含量極顯著高于其余的核桃種子，赫5次之，赫1，赫2，赫3，赫4，赫6，赫7，赫8和普1號核桃種子的脂肪含量均無顯著差異。赫9號核桃種子的碳水化合物含量最高，但只與普1和赫6號核桃有顯著差異，與赫4號核桃有極顯著差異，與其余的核桃種子碳水化合物均無顯著性差異。

表3 核桃碳水化合物含量的特征峰值Table 3 Characteristic absorption peak of carbohydrate in walnut samples

2.4 核桃不同單株種子紅外光譜的聚類分析

圖2顯示了11個核桃單株紅外光譜的聚類分析結果。赫1與赫6，赫4與赫8，赫3與赫7的距離較近，在聚類分析的前3步就各自聚在了一起。普2號核桃由于含有較高的脂肪量，而蛋白質含量較低，與其余核桃的距離最遠，是聚類分析的最后一步。若在距離為0.02時將11個核桃單株分為4類，則赫1，赫2，赫3，赫4，赫6，赫7，赫8為Ⅰ類，赫5與赫9為Ⅱ類，普1為Ⅲ類，普2為Ⅳ類。第Ⅰ類均是采自赫章的泡核桃，具有低脂、低糖、高蛋白的特點。第Ⅱ類是采自赫章的鐵核桃，脂肪與糖含量較高。第Ⅲ類和第Ⅳ類均采自普定，具有高脂、低蛋白的特點，尤其是普2，在11個核桃單株中是脂肪含量最高，蛋白質含量最低的。由此可以看出：核桃紅外光譜的聚類分析結果能夠在一定程度上反映不同地點、不同種類核桃內含物的差異性，說明核桃的紅外光譜特征與其親緣關系之間是有一定聯系的。

圖2 核桃聚類分析圖Figure 2 Cluster analysis result of walnuts

表4 核桃不同單株化學成分的含量的多重比較Table 4 Multiple comparison of chemical composition in walnut samples

3 結論與討論

用采集的11個單株核桃種子的紅外光譜值與核桃中蛋白質、脂肪、碳水化合物的實測值進行相關分析，發現D（1658）/D（3010）特征峰比值與用考馬斯亮藍法測得的蛋白質含量相關系數為0.914，D（1747）/D（3010）特征峰比值與使用索氏抽提法測得的粗脂肪含量相關系數為0.94， D（1100）/D（3010）特征峰比值與使用蒽酮比色法測定的可溶性糖含量相關系數為0.786。由于傅立葉紅外光譜法在1 100 cm－1處的平均峰值，代表的是碳氧伸縮振動與環的振動，是碳水化合物的共同特征峰（包括可溶性糖、纖維素、淀粉等），與可溶性糖化學分析法所得值的相關性明顯低于與蛋白質和粗脂肪的。但以上特征峰值與用經典化學分析法測得的核桃化學成分含量值的相關系數均高于顯著性水平為0.010，自由度為9的相關系數臨界值0.735，即可認為它們是極顯著相關的。因此用11個核桃單株的這3個特征峰比值來做方差分析，結果表明：11株核桃種子蛋白質、脂肪和糖類的特征峰值/參照峰值存在著極顯著性差異，即其相對含量的差異極顯著。通過進一步的多重比較發現，赫3和赫7的蛋白質含量較高，普2的脂肪含量較高，而赫9的糖含量較高。利用紅外光譜峰值對11個核桃單株進行聚類分析，可將不同產地、鐵核桃與泡核桃區分開來，核桃紅外光譜的聚類分析結果可在一定程度上顯示出不同單株核桃化學成分的遺傳差異性。

紅外光譜法不僅可測定化學物質的類型，即確定化學物質紅外吸收峰的歸屬［14］，還可用于衡量化學物質的相對含量［15－16］。通過統計學的方法可以分析傅立葉紅外光譜特征與化學物質實測含量的相關性，從而研究紅外結果的可靠性。本研究利用紅外光譜法測得的核桃化學成分特征峰值與用傳統化學分析方法測得的化學成分含量值相關性較大，因此可將紅外光譜法作為一種快速高效直接的測定核桃種子物質成分組成和相對含量的方法，為核桃的品質鑒定、良種選育、親緣關系鑒定等提供一定的理論依據。

傳統的化學分析方法測定種子中化學物質的含量，由于實驗操作繁瑣，容易出現較大誤差，而且實驗人員需接觸一些有毒化學試劑，危害人體健康。紅外光譜法與傳統測量方法相比，有較多的測量優勢：首先，不必接觸有毒藥品，因此，具有安全無毒的優點；而且紅外光譜法操作簡單，操作過程中容易產生誤差的環節較少，具有高效精準的優點。若能將紅外光譜法更多地應用于檢測植物種子壽命和生活力以及良種鑒定等研究中，并建立相應的數據庫，可創造更多的科學價值。

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Difference analysis using an FTIR spectrum for individual walnuts

YANG Jingyi,XIA Yufang,XIE Zhaojun,TAO Xingyue,DING Xiaoxia
（Forestry College,Guizhou University,Guiyang 550025,Guizhou,China）

To determine an efficient,rapid,and safe measurement for walnuts containing chemical substances, 11 individual Juglans regia walnuts from Hezhang and Puding in Guizhou Province were tested using Fourier transform infrared spectroscopy（FTIRS）.A correlation analysis between FTIR absorbance ratios from the FTIR spectra［D（1658）/D（3010）,D（1747）/D（3010）,and D（1100）/D（3010）］and those from a conventional quantitative chemical analysis was employed.The relative ratios of the peaks in the spectra of the 11 individual walnuts were tested using ANOVA（t=11,n=5）and SNK to show differences in contents for various seed components.Results of the ratios among the main components in the walnuts obtained from the FTIR spectra were in favorable agreement with those from a conventional quantitative chemical analysis and had significant correlation coefficients （r＞r0.01（9）=0.735）.The relative ratios of the peaks in the spectra of the 11 individual walnuts showed various components in the seeds all had significant differences using ANOVA（P=0.01）.So,as an easy,fast,and direct technique,FTIR spectroscopy could be used to characterize components and their relative content of plant seeds and could provide a theoretical foundation for breeding and revealing genetic relationships of walnuts in Guizhou.［Ch,2 fig.4 tab.16 ref.］

cash forestry;Juglans regia;FTIRS;ANOVA；cluster analysis

S722.3；S664.1

A

2095-0756（2015）03-0420-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.03.014

2014-02-24；

2014-04-17

貴州省重大科技專項（黔科合重大專項字［2011］6011號）；貴州大學青年教師科研基金資助項目（貴大自青基合字［2012］006號）

楊靜怡，助教，從事森林培育和城市林業等研究。E-mail：goldfishyy@163.com。通信作者：夏玉芳，教授，從事森林培育和木材利用等研究。E-mail：yfxia0398@qq.com