糯大麥與非糯大麥種子萌發(fā)和胚乳消亡的比較研究

邵珊珊，李發(fā)麗，余徐潤，熊 飛

(揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225000)

隨著人們對(duì)大麥用途和營養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的不斷加深，大麥需求量逐年增加，應(yīng)用發(fā)展前景十分廣闊[1]。啤酒大麥的需求量也在逐年遞增，中國目前已成為世界啤酒大麥第一進(jìn)口國[2]。大麥穎果是生產(chǎn)大麥啤酒的原材料，胚乳是大麥穎果的重要組成部分，占粒重的90%以上[3]，主要貯藏物質(zhì)為淀粉和蛋白質(zhì)。Van Dongen等[4]和劉 美等[5]研究發(fā)現(xiàn)，胚乳中淀粉、蛋白質(zhì)等儲(chǔ)藏物質(zhì)不僅為大麥種子萌發(fā)和幼苗早期生長提供了必要的能量供應(yīng)，也是能量和營養(yǎng)物質(zhì)的最主要來源。同時(shí)，大麥籽粒中的其他內(nèi)含物如多糖、脂肪、灰分等也為大麥的萌發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[6-7]。有研究指出[8]，種子萌發(fā)是多種激素相互作用的結(jié)果；也有研究指出，淀粉酶和蛋白酶活性是決定大麥種子萌發(fā)速率的關(guān)鍵因素，胚乳中醇溶蛋白的聚合程度可以影響大麥的萌發(fā)速率[9]。胚乳細(xì)胞中的醇溶蛋白聚合體能包裹淀粉顆粒，種子萌發(fā)過程中淀粉酶與淀粉顆粒的接觸、結(jié)合是淀粉顆粒降解所必須的，而未降解的醇溶蛋白聚合體的存在則阻礙淀粉降解酶的移動(dòng)及其與淀粉的結(jié)合，進(jìn)而限制淀粉水解[10]。目前，有關(guān)大麥萌發(fā)的研究較多[11-13]，但關(guān)于糯大麥與非糯大麥種子萌發(fā)和胚乳消亡的對(duì)比研究則較少。因此，本研究以典型糯大麥品種及非糯大麥品種為材料，采用組織化學(xué)染色、樹脂半薄切片和光學(xué)顯微鏡觀察等方法比較研究糯大麥與非糯大麥種子萌發(fā)過程中胚乳的消亡，以期為不同類型大麥在釀酒業(yè)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糯大麥：白青稞(C2-2)和甘墾5號(hào)，由北京農(nóng)科院提供；非糯大麥：揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)和蘇裸麥1號(hào)，由揚(yáng)州大學(xué)提供。大麥種子經(jīng)1%次氯酸鈉消毒30 min后，用清水洗凈并晾干。暗環(huán)境下浸種12 h后置于含有2層紗布的培苗盤，25 ℃催芽。當(dāng)大麥胚根長約為種子長的1/2時(shí)即視為發(fā)芽，開始光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照25 ℃，16 h；黑暗18 ℃，8 h，定期等量補(bǔ)充水分。

1.2 種子組織化學(xué)染色

將不同萌發(fā)天數(shù)的大麥種子縱切，室溫下用I2/KI(0.3%I2+1%KI)染色10 s，置于體視顯微鏡下觀察穎果剖面著色情況。I2/KI染液可將含有淀粉的部位染成藍(lán)黑色或紅褐色，通過觀察剖面著色情況判斷淀粉的消耗情況。

1.3 胚乳淀粉體顯微結(jié)構(gòu)觀察

取不同萌發(fā)天數(shù)的大麥種子，用刀片將需觀察部位切成厚2 mm的薄片，放入2.5%戊二醛前固定液，4 ℃固定4 h，再經(jīng)1%鋨酸后固定、磷酸緩沖液(pH 7.2)清洗、乙醇系列脫水、環(huán)氧丙烷置換、低黏性Spurr樹脂浸透和包埋，于70 ℃聚合成樹脂樣品塊。采用超薄切片機(jī)制作成厚1 μm 的薄片，經(jīng)0.5%甲基紫和1%番紅染液復(fù)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件分析處理數(shù)據(jù)；采用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示；采用Adobe Photoshop CC 2017軟件進(jìn)行拼圖比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥種子萌發(fā)情況

由表1可知，萌發(fā)3 d時(shí)，蘇裸麥1號(hào)的總根長顯著高于其他3個(gè)大麥品種，且揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)的總根長最短；萌發(fā)4 d時(shí)，不同品種的發(fā)芽勢(shì)存在顯著差異，其中白青稞的發(fā)芽勢(shì)最高，為99.0%，揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)最低，為86.8%；萌發(fā)5 d時(shí)，蘇裸麥1號(hào)的芽長顯著高于其他品種大麥，且4個(gè)品種大麥間總根長存在顯著性差異；萌發(fā)7 d時(shí)，甘墾5號(hào)的芽長顯著低于其他品種，且4個(gè)品種間的總根長和發(fā)芽率均存在顯著差異。由此發(fā)現(xiàn)，隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，糯大麥和非糯大麥種子萌發(fā)情況趨于穩(wěn)定，總體上表現(xiàn)為糯大麥種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率高于非糯大麥，說明糯大麥種子的發(fā)芽情況優(yōu)于非糯大麥。

2.2 大麥種子萌發(fā)過程中胚乳的消耗過程

由圖1可知，隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，胚乳逐漸吸水膨脹并伴隨物質(zhì)降解，結(jié)實(shí)的固體狀物質(zhì)變成松軟的乳狀物質(zhì)，最后胚乳內(nèi)物質(zhì)完全消失。萌發(fā)2 d時(shí)，靠近盾片的胚乳開始消耗；且近胚端的胚乳變?yōu)槟z狀物質(zhì)，此時(shí)，遠(yuǎn)胚端的胚乳尚未被消耗；萌發(fā)7 d時(shí)，絕大部分胚乳變成膠狀物質(zhì)并被消耗掉，I2/KI溶液染色不明顯。由此可見，糯大麥和非糯大麥胚乳的消亡均是由近胚端開始，沿腹溝向遠(yuǎn)胚端延伸，且在種子萌發(fā)過程中，糯大麥胚乳的消亡速度明顯快于非糯大麥。

表1 大麥種子萌發(fā)過程中的芽長、根長、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率Table 1 Shoot length,root length,germination vigor and germination rate during the germination of barley seeds

同行數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示品種間在0.05水平差異顯著。

Different letters within the same columns indicate significant differences at 0.05 level.

AL:糊粉層；Em:胚；En:胚乳；Sc:盾片；圖中左側(cè)數(shù)字為大麥萌發(fā)天數(shù)。

AL:Aleurone layer；Em:Embryo；En:Endosperm；Sc:Scutellum；The numbers on the left of the figure show days of barley germination.

圖1大麥種子胚乳的消亡(I2-KI染色法)

Fig.1Extinctionofendospermduringgerminationofbarleyseeds(I2-KIstaining)

2.3 大麥種子萌發(fā)過程中胚乳淀粉體形態(tài)及數(shù)量的變化

2.3.1 近糊粉層胚乳中淀粉體的變化

大麥萌發(fā)早期，胚乳細(xì)胞中淀粉體排列緊密且充實(shí)緊湊。隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，胚乳細(xì)胞中淀粉體間隙變大，排列疏松，大、小淀粉體的數(shù)量均發(fā)生變化(圖2)。萌發(fā)3 d時(shí)，近糊粉層胚乳中的淀粉體最先消亡，在糊粉層與內(nèi)胚乳細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙，糯大麥近糊粉層胚乳中淀粉體(圖2G和圖2J)的消亡早于非糯大麥(圖2A和圖2D)。萌發(fā)5 d時(shí)，靠近糊粉層的胚乳細(xì)胞已解體，胚乳細(xì)胞中的淀粉體大量降解，糊粉層與胚乳細(xì)胞間存在明顯的縫隙，且糯大麥(圖2H和圖2K)的縫隙明顯大于非糯大麥(圖2B和圖2E)。萌發(fā)7 d時(shí)，近糊粉層胚乳細(xì)胞中的淀粉體出現(xiàn)更大程度的降解，糯大麥?zhǔn)Ｓ嗟矸垠w數(shù)量少于非糯大麥，即糯大麥胚乳淀粉體(圖2I和圖2L)消亡速度快于非糯大麥(圖2C和圖2F)。

AL：糊粉層；En:胚乳；Pe:果皮；圖上方數(shù)字表示大麥萌發(fā)天數(shù)。下同。

AL：Aleurone layer；En:Endosperm；Pe:Pericarp；The numbers on the top of the figure show days of barley germination.The same below.

圖2大麥種子萌發(fā)過程中近糊粉層淀粉體的消亡

Fig.2Extinctionofstarchgranulesnearbyaleuronelayerduringgerminationofbarleyseeds

2.3.2 內(nèi)胚乳中淀粉體的變化

萌發(fā)3 d時(shí)，糯大麥胚乳細(xì)胞中大淀粉體表面開始出現(xiàn)明顯缺痕(圖3G和圖3J)，而非糯大麥胚乳淀粉體較為完整(圖3A圖3D)。萌發(fā)5 d時(shí)，糯大麥糊粉層與胚乳細(xì)胞(圖3H和圖3K)間的縫隙明顯大于非糯大麥(圖3B和圖3E)，胚乳淀粉體也大量降解。萌發(fā)7 d時(shí)，糯大麥胚乳中含有少量正在解體的大淀粉體，小淀粉體幾乎被消耗(圖3I和圖3L)，而非糯大麥胚乳中還含有較多的淀粉體殘留(圖3C和圖3F)。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，在大麥萌發(fā)過程中，近糊粉層淀粉體消亡時(shí)間早于內(nèi)胚乳，同一部位小淀粉體消亡時(shí)間早于大淀粉體，且在淀粉體表面先出現(xiàn)許多小坑，而后整粒淀粉被消化殆盡；糯大麥胚乳淀粉體的消亡較早，消亡速度也快于非糯大麥。

3 討 論

種子萌發(fā)受環(huán)境因素、內(nèi)部因素及萌發(fā)相關(guān)基因的共同調(diào)控[14-15]。其中，環(huán)境因素涉及水分、溫度和光照等[14]；內(nèi)部因素包括種子大小、種皮特征和種子休眠等[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相同生長環(huán)境下糯大麥種子的萌發(fā)較好，發(fā)芽率也較高，表明糯大麥和非糯大麥種子的內(nèi)部因素及與萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)存在一定差異。在種子萌發(fā)過程中，隨著籽粒內(nèi)貯藏物質(zhì)的水解和消化，胚乳內(nèi)含物逐漸變成漿狀，殘留的淀粉體游離其中。淀粉在淀粉酶和各種轉(zhuǎn)化酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化，在完整的淀粉顆粒上出現(xiàn)一些缺痕和微孔，并隨淀粉顆粒降解程度的加深逐漸深化或變大[17]。本研究也觀察到了類似的結(jié)果。

本研究結(jié)果還表明，大麥種子萌發(fā)過程中胚乳的消耗表現(xiàn)出一定的時(shí)序性，這與Yu等[18]的研究結(jié)果類似。首先是近胚端和靠近盾片的區(qū)域開始消耗，隨后是靠近糊粉層的背部區(qū)域，最后沿腹溝延伸至遠(yuǎn)胚端。這可能是因?yàn)槊劝l(fā)早期盾片需要分泌大量的酶蛋白來水解胚乳中的貯藏物質(zhì)[19]，同時(shí)來自糊粉層中的糊精酶也有助于降解胚乳細(xì)胞壁和淀粉粒壁層[20]。另外，糊粉層產(chǎn)生的淀粉酶在降解胚乳中起主要作用[21]。本研究表明，在大麥萌發(fā)過程中，近糊粉層淀粉體消亡時(shí)間早于內(nèi)胚乳，同一部位小淀粉體消亡時(shí)間早于大淀粉體，這與袁秋華[21]的研究結(jié)果一致。袁秋華[21]的研究還指出，蛋白體和小淀粉體均先于大淀粉體被消耗。Li等[22]通過酶解研究發(fā)現(xiàn)，小淀粉體在早期的水解速度快于大淀粉體，而后期水解速度則小于后者，這可能與2種淀粉體的表面積-體積比、蛋白質(zhì)含量等有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，糯大麥胚乳淀粉的消亡時(shí)間早于非糯大麥，且其降解速度也快于后者，這可能與前者的支鏈淀粉含量較高有關(guān)[23]。而對(duì)于產(chǎn)生這些結(jié)果的具體機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。