庫蠓核糖體DNA內轉錄間隔區1序列的測定與分析

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庫蠓(CulicoidesLatreille)俗稱“墨蚊”、“小咬”，隸屬于昆蟲綱(insecta)、雙翅目(diptera)、蠓科(ceratopogonidae)，全世界現有1 368種、中國已知348種[1-2]，是引起野生和家養反芻動物流行病的重要媒介昆蟲，其通過刺吸動物血液來傳播藍舌病(BT)、家畜流行病出血熱(EHD)、非洲馬瘟病(AHS)等諸多動物傳染病[3]。上述疾病的病原通過媒介庫蠓和易感宿主之間的一系列復制循環而持續存活于自然界中[4]，因而其易于引發醫療衛生和獸醫等領域的家畜流行病，從而造成牛、羊等養殖業的巨大經濟損失，歐洲曾發生過藍舌病大流行[5-6]，國內云南、廣西、新疆和內蒙古等29個省也曾先后在牛羊血液中檢測出藍舌病病毒(BTV)[7]。目前，BT和AHS已被世界動物衛生組織(OIE)列為A類傳染病[8]，中國也將BT列為一類動物疫病[9]。

庫蠓體型微小、鑒別特征稀少，傳統分類鑒定尚存在諸多問題。首先是非成蟲階段的蟲態和蟲體殘缺的成蟲均難以鑒定，其次受庫蠓性別限制，雄蟲借助外生殖器等形態特征易于鑒別，而雌蟲缺乏良好的尾器特征而不易鑒別，最后庫蠓表型可塑性和遺傳可變性等也容易導致誤判[10-12]。因此，庫蠓分類中亟需快速、準確鑒定種類的技術方法，對蠓傳疾病的監控、防治具有重要意義。

隨著分子生物學和生物信息學的快速發展，分子生物學技術已應用于昆蟲分類鑒定和系統演化等領域，這在很大程度上彌補了傳統形態分類的不足，尤其是近似種或隱種的分類[13-15]。在昆蟲核基因中，串聯重復是核糖體DNA(rDNA)的存在形式，同時其一個轉錄單元包括18S、5.8S、28S三個部分，而ITS1和ITS2兩個可變區則分別位于18S和5.8S以及5.8S 和28S之間[16]。目前，昆蟲分子系統學研究也主要集中在rDNA的ITS、28S rRNA和18S rRNA等區域。高度保守的序列通常應用于高級分類階元的系統發育研究，如28S rRNA和18S rRNA[17]；而變異較大、選擇壓力小的序列則適用于種屬水平上的研究，如ITS1和ITS2序列[18]，且已廣泛應用于媒介昆蟲的種類鑒定[19-20]。然而，蠓科昆蟲的分子系統學研究，自1992年Tabachnick等[21]報道變翅庫蠓(Culicoidesvariipennis)種群的基因差異開始，之后國外關于蠓科分子系統學的研究與日劇增[22-26]，但國內相關研究嚴重不足。

因此，本研究以埃蠓屬的環紋埃蠓Alloheleaannulata為外群，對庫蠓屬中的凹緣庫蠓C.holcus、連斑庫蠓C.jacobsoni、印度庫蠓C.indianus、荒川庫蠓C.arakawai、霍飛庫蠓C.huffi和肩宏庫蠓C.humeralis等6種庫蠓進行分類研究(凹緣庫蠓C.holcus、和連斑庫蠓C.jacobsoni為二囊亞屬近似種)，通過聯合形態學特征和核糖體DNA-ITS1序列數據，彌補傳統形態鑒定的不足，進一步證實ITS1序列在庫蠓及其近似種的分類鑒別方面的適用性，為解決蠓科昆蟲分類中形態學數據難以解決的問題提供更多的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1庫蠓標本 本研究共使用7種23只蠓蟲標本的數據，其中18只為本研究組2015年7月采自廣西大瑤山自然保護區，其余5只的數據來自GenBank數據庫，詳見表1。

1.1.2主要試劑及儀器 基因組提取試劑盒(QIAGEN, 德國)、pEASY-T1克隆試劑盒(北京全式金公司, 中國)、PCR MasterMix(TIANGEN, 中國)、引物(上海捷瑞生物工程有限公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN, 中國)、瓊脂糖(Biowest Agarose, 西班牙)、PCR擴增儀(美國BOI-RAD公司)、UVP凝膠成像系統(美國BOI-RAD公司)等。

1.2 方法

1.2.1庫蠓采集 采用網捕法和燈誘法，在廣西大瑤山自然保護區不同生境設置采樣點進行蠓蟲收集，并將其保存于無水乙醇中。

1.2.2標本鑒定 按照常規方法進行標本的分選、解剖、制片、鑒定以及拍照，且胸部標本單獨編號保存在無水乙醇中。

1.2.3基因組DNA 將庫蠓標本研磨至無明顯組織塊，按照QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit說明書進行其基因組DNA提取，并保存至-20 ℃備用。

1.2.4PCR擴增 PCR擴增的上游引物為PanCulF (5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′)，下游引物為PanCulR (5′-TGCGGTCTTCATCGACCCAT-3′)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR擴增的體系如表2所示，其反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，循環5次；94 ℃ 60 s，44 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，循環35次；最后68 ℃延伸10 min。

表1 供試庫蠓的詳細信息Tab.1 Detailed information of the biting midges in this study

表2 PCR擴增體系Tab.2 PCR amplification system

1.2.5PCR擴增產物純化、克隆及測序 將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，同時利用DNA回收試劑盒進行DNA產物的純化，之后使用pEASY-T1克隆試劑盒進行DNA克隆，最后用60%甘油保存陽性克隆菌液并送至上海生物工程股份有限公司進行雙向測序。

1.2.6rDNA-ITS1序列分析 利用Clustal X、DNA MAN、MEGA 6.06等軟件對本研究中rDNA-ITS1序列進行比對、編輯、比較等分析，統計序列中各堿基(A、T、C、G)的組成比例以及保守位點(Conserved sites, C)、變異位點(Variable sites, V)、簡約信息位點(Parsim-Imformative sites, Pi)和自裔位點(Singleton sites, S)的數量。同時，以Kimura雙參數模型計算遺傳距離，并以環紋埃蠓A.annulata為外群，通過鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)構建分子系統樹，并通過Bootstrap 1 000次自舉檢驗系統樹中各結點的置信值。

1.2.7統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差表示。兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1形態學特征對比 本研究內群的6種庫蠓形態上比較接近，尤其是凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni最為近似，以凹緣庫蠓C.holcus、連斑庫蠓C.jacobsoni和荒川庫蠓C.arakawai為例(表3、圖1)進行形態特征比較。上述3種庫蠓中雄蟲可根據其尾器的4個特征進行有效鑒別，但雌蟲中僅荒川庫蠓C.arakawai可直接根據頭部、翅部和腹部的明顯差異進行準確區分，另外二囊亞屬的兩近似種除翅部特征的細微差別外，余未見差異，故鑒定非常困難。

表3 本研究三種庫蠓形態特征對比Tab.3 Comparison of morphological features of three Culicoides

1：凹緣庫蠓C.holcus；2：連斑庫蠓C.jacobsoni；3：印度庫蠓C.indianus；4：荒川庫蠓C.arakawai(雌)；5：荒川庫蠓C.arakawai(雄)；6：環斑埃蠓A.annulata；7：霍飛庫蠓C.huffi；8：肩宏庫蠓C.humeralis圖1 庫蠓近似種一側翅圖Fig.1 Wing of one side of sibling species

2.2DNA序列分析 本研究獲得的DNA序列經Clustal W比對和人工校對后，得到rDNA-ITS1的序列長度為352 bp，該序列中存在較多的插入和缺失位點。通過MEGA 6.06軟件分析ITS1序列中T、C、A、G四種堿基的平均含量分別為36.8%、13.0%、30.0%和20.1%，其中A+T平均含量約為66.8%，C+G平均含量約為33.1%；而在3個密碼子位點中，第1位點的A+T含量相對最高(67.7%)，第3位點A+T平均含量相對最低(64.6%)。此外，ITS1序列中保守位點(C)、變異位點(V)、簡約信息位點(Pi)和自裔位點(S)的個數分別為163、189、182和7，其中變異位點(V)占比約為53.7%。

2.3序列同源性比對 將本研究所獲全部庫蠓ITS1序列與GenBank數據庫中的序列進行同源比對，搜索到部分同源序列，即荒川庫蠓C.arakawai(登錄號：AB462265、AJ489503，序列相似度：99%)、連斑庫蠓C.jacobsoni(登錄號：AB462262，序列相似度：97%)、印度庫蠓C.indianus(登錄號為AB462268，序列相似度：93%)。

2.4遺傳距離 利用MEGA 6.06軟件計算本研究中蠓蟲ITS1序列的遺傳距離，種內和種間的遺傳距離范圍分別為0.000～0.020和0.113～0.621，通過統計軟件分析得出種內組和種間組的遺傳距離(均數±標準差)分別為0.009±0.008和0.391±0.169，兩者差異具有統計學意義(t=32.430,P<0.05)。

2.5系統發育分析 以環紋埃蠓A.annulata為外群，采用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)分別構建6種庫蠓的系統發育樹，得到基本一致的拓撲結構(圖2、3)。系統發育樹聚類分析表明：1)各物種間分別構成單系(群)，同種不同地理種群聚為一支，且種間無交叉。2)物種間親緣關系明顯，二囊亞屬的凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni兩種首先聚在一起，親緣關系較近并構成一個姊妹群，再與庫蠓亞屬的印度庫蠓C.indianus并為一大支，同時帶紋亞屬的荒川庫蠓C.arakawai與三囊亞屬的肩宏庫蠓C.humeralis親緣關系較近先聚為一小支，再與屋室亞屬的霍飛庫蠓C.huffi結合構成一大支，之后兩大支聚合形成內群，而外群埃蠓屬的環紋埃蠓A.annulata在樹的根部，外群與內群形成完整的有根樹。

各分支上的數字為自舉檢驗置信值1 000次圖2 基于rDNA-ITS1序列構建的NJ樹Fig.2 Neighbor-Joining tree constructed based on rDNA-ITS1 sequence

各分支上的數字為自舉檢驗置信值1 000次圖3 基于rDNA-ITS1序列構建的ML樹Fig.3 Maximum Likelihood tree constructed based on rDNA-ITS1 sequence

3 討 論

核糖體DNA內轉錄間隔區1 (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1, rDNA-ITS1)基因位于核糖體DNA的18S和5.8S之間，其特點為：①屬于中度重復序列；②不承擔編碼蛋白質的功能，也不參與核糖體的形成，故承受的選擇壓力較小，進化速度相對較快，從而具有高變性；③在ITS1序列兩側的18S和5.8S序列具有保守性，便于通用引物的設計、PCR擴增和測序；④序列的組成、長度以及折疊方式存在多態性，可用于屬、種和種群水平的研究[27-28]。目前，應用ITS1解決親緣關系較近的庫蠓分類以及系統關系的研究較多，如Mathieu等[29]通過設計ITS1-5.8S-ITS2 的TaqMan 探針對不顯庫蠓(Culicoidesobsoletus)和蘇格蘭庫蠓(Culicoidesscoticus)進行雙重實時熒光定量PCR實驗，Deblauwe等[30]通過設計ITS1的DNA微陣列形式的探針雜交對不顯庫蠓種群(Obsoletusgroup)的庫蠓進行分子鑒定，說明ITS1是庫蠓種間和種內遺傳分化程度及系統進化研究的良好指標。因此，基于庫蠓形態特征和rDNA-ITS1序列數據的基礎上對6種吸血蠓進行鑒定和分析，其研究結果表明形態學特征與分子數據具有一致性，共同驗證了rDNA-ITS1基因序列在吸血庫蠓(包括近似、近緣種)鑒別和系統發育研究中的適用性。

本研究rDNA-ITS1序列的堿基組成中A+T的平均含量(76.8%)遠高于C+G的平均含量(33.2%)，具有AT偏向顯著。同時，該序列的變異位點(189個)較多，占比約為53.7%，且相對于線粒體基因(如COI和Cytb)其還存在較多的插入和缺失位點。Cêtre-Sossah等[31]利用ITS1序列對盛行于非洲和歐洲的藍舌病及非洲馬瘟病的主要傳播媒介庫蠓——殘翅庫蠓C.imicola進行分子鑒定，通過設計特異引物可得到長度各不相同的ITS1擴增產物，根據電泳條帶的位置即可進行種類鑒別；同時，Gomulski等[32]利用rDNA-ITS2序列探究庫蠓亞屬及近緣種的系統發生，研究發現其存在明顯的多態性，表明絕大多數庫蠓的ITS序列存在多態性，而并非是由于PCR擴增過程中產生的錯誤所致。

進一步對庫蠓遺傳距離研究發現，各種間遺傳距離(0.113～0.621)明顯大于各種內遺傳距離(0.000～0.020)，其中最大種內遺傳距離(印度庫蠓C.indianus：0.020)亦小于最小種間遺傳距離(凹緣庫蠓C.holcus與連斑庫蠓C.jacobsoni：0.113)，進一步說明庫蠓種間和種內遺傳距離不存在重疊區，足以進行準確區分。同時，種間平均遺傳距離(0.411)為種內平均遺傳距離(0.010)的41倍，也完全符合Hebert 等[33-34]提出的物種鑒定規則。因此，rDNA-ITS1基因可應用于庫蠓的分子分類。然而，本研究中印度庫蠓C.indianus的種內遺傳距離相對其他種類略大(0.020)，Matsumoto等[35]在基于ITS1和ITS2對25種庫蠓進行研究的過程中發現印度庫蠓C.indianus存在ITS1長和短兩種序列類型，這可能就是造成本研究中其種內遺傳距離偏大的原因。另外，關于昆蟲近緣種雜交的問題，Pesson等{36]在對白蛉亞科昆蟲進行研究時發現其確實存在近緣物種雜交，但本研究中采自統一地點的凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni并未發現任何基因滲透現象，這與Ritchie等[37]和Augot等[15]關于庫蠓的研究結果相一致。

此外，在對6種庫蠓的DNA序列聚類分析研究中發現，其與形態學鑒定和遺傳距離計算的結果基本相同，如凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni兩近似種同屬二囊亞屬，其形態學特征相似且種間遺傳距離(0.113)最小，在系統發育樹中優先聚在一起構成姊妹群。然而，來自日本的連斑庫蠓C.jacobsoni(AB462262.1)與我國廣西的種類首先分開，從拓撲結構上來看我國廣西的凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni聚為一支，但是從時間節點和分支長短來看同屬連斑庫蠓C.jacobsoni的種類具有更近的親緣關系。此外，構建的NJ樹和ML樹的拓撲結構也基本一致，在種間和種內的分支上均具較高的置信值，說明應用rDNA-ITS1基因構建的分子進化樹能明顯區分庫蠓及其近似種，可靠程度較高。然而，荒川庫蠓C.arakawai和肩宏庫蠓C.humeralis的種內存在置信值高低不等的差異，這與Gomulski 等[38]在基于同為核糖體DNA-ITS區的 ITS2序列對包括不顯庫蠓Culicoidesobsoletus在內的二囊亞屬進行系統發育關系的研究過程中的情況類似，究其原因可能主要是兩種建樹方法之間存在建樹理論基礎和建樹偏向性方面的差異。與此同時，在種內個別分支上亦存在相對較低的置信值，如凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni之間的置信值僅為51，這與李瑋瑋[39]等對小蔗螟的研究以及秦芳[40]等對利川馬遺傳多態性的研究得到的結果相似，其可能是由于ITS1序列在堿基組成及變異速度方面存在差異以及ITS1序列片段短(352 bp，且存在插入和缺失位點)和樣本數量少(n=23)等導致提供的有效分子遺傳學信息有限有關。

在廣泛使用ITS1等核糖體內轉錄間隔區的基因序列進行分析時，發現它存在基因的橫向轉移、重復以及外顯子拼接、域拼接等非線性的現象，說明其并非對所有物種都具有適用性[28]。同時，在核基因組研究中發現其存在線粒體假基因(NUMTs)的插入現象，這毋庸置疑是影響核基因的分子鑒定過程中準確性的又一不利因素[41]。目前，蠓科學者在進行庫蠓的系統發育分析時，不僅僅是從傳統形態學角度進行單因素的分析，同時還聯合線粒體基因、核基因，甚至是三維形態重建等多方面進行綜合比對分析，如Augot等[15]聯合Cytb、CO I、ITS1和形態學特征可進行翅痣庫蠓(Culicoidesstigma)和帕羅庫蠓(Culicoidesparroti)等近似種的準確鑒別。同時，分類學家們也在不斷發掘新的分子標記和分類技術，如CAD基因和幾何形態學等在庫蠓的分子系統學研究中的應用[42-43]。因此，在后續的昆蟲分子系統學研究領域中的趨勢將是結合生態學、形態學特征和多個分子標記數據等多重分類變量以及開發新分子標記和分類技術來進行更為全面、系統的分析。