127株結核分枝桿菌基因分型及耐藥相關研究

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2017年發布的全球結核病報告顯示，2016年新發現大約1 040萬結核病例，印度、印度尼西亞、中國、菲律賓和巴基斯坦5個國家占56%[1]。利用結核分枝桿菌遺傳標志物(具有遺傳的穩定性和個體的多樣性)對結核分枝桿菌臨床分離株進行分型研究，證實菌株的基因多態性，以此了解結核病的流行病學特征、分析患者產生耐藥的原因、推斷病原演變情況等，對于防治結核病具有重要的意義[2-3]。基于PCR技術的MLVA方法，由于其特異性高、分辨率強、效果明顯、操作簡單方便和重復性好，美國疾病控制和預防中心推薦其為首選的結核桿菌基因分型方法[3]。因為在不同區域VNTR位點及位點組合有差異性，所以各個實驗室都在盡力尋找適合當地的位點。本研究采用MLVA技術，選取15個VNTR位點對山西省的127株結核分枝桿菌進行基因分型及藥敏試驗，以初步了解山西長治及周邊地區結核分枝桿菌分子流行病學特征及耐藥性，為山西省預防和治療結核病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1菌株 127株結核分枝桿菌菌株分別分離自長治市、晉城市和臨汾市的臨床患者痰標本，其中長治106株，晉城20株，臨汾1株。患者年齡16～90歲，平均44歲；男80例(63%)，女47例(37%)；農民75例(59.06%)，學生14例(11.02%)，其他38例(29.92%)。長治醫學院附屬和平醫院微生物學實驗室負責菌株的培養、鑒定和保存。菌株H37Rv作為參照標準(中國疾病預防控制中心提供)。

1.2主要儀器與試劑 MasterMix(Beijing TsingKe Biotech Co., Ltd)、DL l 000 DNA Marker(Takara)、GoldenView(Aidlab Biotechnologies Co., Ltd)、瓊脂糖、PCR擴增儀、凝膠成像儀及BioNumerics 5.0 分析軟件。

1.3基因分型 依據參考文獻選取15個VNTR位點[2,4-7](表1)。

表1 15個位點的引物、H37Rv重復單元和擴增片段的長度及重復次數Tab.1 Primers of 15 locus and the size of repeat, the size of PCR product and the number of repeats of H37Rv strain

15個VNTR位點的引物依據參考文獻合成。

DNA提取：收集適量經Lowenstein Jensen(LJ)培養基培養的菌體于400 μL蒸餾水懸菌，100 ℃金屬浴滅活裂解30 min，14 000 r/min的速度離心10 min，-20 ℃保存上清液以備用。

PCR：混合物總體積為25 μL：DNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×TaqDNA酶13 μL，三蒸水9 μL。PCR反應條件：預變性94 ℃ 10 min，變性94 ℃ 1 min，退火56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35個循環，最后延伸72 ℃ 10 min。PCR產物在4 ℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳：取5 μL擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳(含5 μL/100 mL Golden View)，置于紫外凝膠成像儀下觀察結果，與DNA marker進行比較，估測PCR擴增產物的相對分子質量。實驗中以H37Rv作為陽性對照。

1.4藥敏試驗 對8種抗結核藥物分別采用比例法進行藥物敏感性試驗。培養基中8種藥物的終濃度分別為異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，鏈霉素(SM)4.0 μg/mL，卡那霉素(KN)30 μg/mL，丙硫異煙胺(PTH)40 μg/mL，對氨基水楊酸(PAS)1.0 μg/mL，左氧氟沙星(LFX)4.0 μg/mL[5]。耐藥標準：含藥培養基與對照培養基的菌落數相比，小于l%為敏感，大于或者等于l%為耐藥[5]。

1.5數據分析 每株菌株的PCR擴增條帶均與H37Rv比較，確定每株菌株各個VNTR位點重復單元的重復次數，計算Hunter-Gaston指數(HGI)分析各位點的分辨能力。采用BioNumerics 5.0軟件進行聚類分析，聚類方式用平均連鎖聚類法(UPGMA)，根據cluster-cutoff值差異進行基因分型。采用統計軟件SPSS l7.0進行統計分析，運用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行組間差異比較，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1基因多態性和聚類分析 運用MLVA方法對127株結核分枝桿菌進行基因分型，DNA指紋圖譜顯示不同菌株表現出明顯的基因多態性。15個VNTR位點中，Mtub21、MIRU26 和ETRE位點多態性較高(HGI>0.6)；MIRU10、 ETRA、MIRU27、Mtub39 、Mtub30和MIRU39位點呈中等程度的多態性(0.3

圖1 127株菌株MLVA基因分型聚類分析Fig.1 Clustering analysis of 127 strains by MLVA

表2 15個VNTR位點的Hunter-Gaston指數Tab.2 Hunter-Gaston Index of 15 VNTR loci

注：1.Hunter-Gaston指數：分析VNTR位點重復單元多樣性的指數(0.0≤HGI≤1.0)；2.可信區間：多樣性指數的95%可信區間。

2.2藥敏試驗 根據臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準對127株結核分枝桿菌進行藥物敏感性試驗[8]。實驗結果顯示：127株菌株對一線和二線抗結核藥物的總耐藥率分別為47.24%和23.62%。一線抗結核藥物的耐藥率：鏈霉素(40.94%)最高，依次是異煙肼(32.28%)、利福平(24.41%)，乙胺丁醇(6.30%)最低；二線抗結核藥物的耐藥率：左氧氟沙星(14.17%)最高，其次是卡那霉素(8.66%)、對氨基水楊酸(7.09%)，丙硫異煙胺(3.15%)最低。鏈霉素的單耐藥率最高(11.81%)，其次是異煙肼(2.36%)，未發現利福平和乙胺丁醇的單耐藥菌株；耐多藥率為21.26%(27/127)，其中有5株(3.94%)菌株對四種藥物同時耐藥；廣泛耐多藥率為3.15%(表3)。

2.3基因型與耐藥的關系 Ⅰ群菌株與其它菌株對一線和二線藥物的總耐藥率、一線和二線藥物的耐藥率、單耐藥率、耐多藥率、廣泛耐多藥率如下。Ⅰ群菌株與其它菌株的耐藥率進行比較，兩者間的差異無統計學意義(α=0.05)(表4)。

表3 127株菌株的耐藥情況Tab.3 Drug resistance of 127 strains

3 討 論

MLVA基因分型方法有很多優點，不僅特異性高、穩定性強，且操作簡便、重復性好，檢測結果還可以數字表示，不同實驗室之間可相互進行比較。

本研究采用15個VNTR位點對山西省的127株結核分枝桿菌進行基因分型，結果顯示Mtub21、MIRU26和ETRE對于分析山西省的結核分枝桿菌有較高的多態性；MIRU40、ETRB、ETRD、MIRU23、 ETRC的多態性較差。先前研究發現，在北京[9]QUB11b、Mtub21、MIRU39和MIRU16的多態性較高，青海省[4]菌株中多態性最好的是MIRU26，徐州[5]結核分枝桿菌的實驗過程中發現MIRU26和Mtub21多態性較好，西藏地區[10]主要是MIRU31、Mtub21和ETRE多態性較高，四川地區[11]QUB11b和MIRU26的多態性較好，在韓國MIRU26和ETRE的區分力較高[12]，提示不同地區VNTR位點的多態性不同，Mtub21、MIRU26和ETRE位點在實驗菌株的分析方面發揮著重要作用。127株菌株分為11個基因群，以Ⅰ群菌株(80.31%)為主，說明這些菌株屬于親緣關系很近的同一個克隆系，可能為山西長治及周邊地區的主要流行菌株，應加強對這類菌株的研究[13]。

表4 不同基因型菌株的耐藥性比較Tab.4 Drug resistance comparing in different genotype among strains

注：1，Fisher確切概率法

耐藥結核病的流行，尤其是耐多藥患者增多，病程漫長，傳染風險極高，是我國結核病疫情居高不下的重要原因[14]。2010年開展的全國結核病流行病學調查顯示：一線、二線藥物的總耐藥率為36.8%和24.6%，耐多藥率6.8%[15]。

本次研究結果：一線藥物的總耐藥率為47.27%，耐多藥率為21.26%，顯然高于2010年全國調查結果，表明長治及周邊地區結核病耐藥狀況仍然比較嚴重。一線藥物中鏈霉素的敏感性較低，乙胺丁醇的敏感性較高，二線藥物中左氧氟沙星的敏感性較低。鏈霉素是廣譜抗生素，必須與其它藥物聯合使用，但因其對神經和腎的副作用，很多患者不按標準方案用藥或中途停藥，部分醫生用藥不規范，是造成鏈霉素耐藥的重要因素[16]。因左氧氟沙星利于痰菌轉陰、影像學療效改善和不良反應少，成為治療耐多藥肺結核的最佳輔助選擇，但氟喹諾酮類藥物對其它致病菌較強的殺菌作用而被普遍使用，增加了它的耐藥率[16-17]。一線藥物中鏈霉素和異煙肼的單耐藥率較高，未發現利福平和乙胺丁醇的單耐藥菌株，二線藥物的敏感性高于一線藥物。臨床用藥建議：充分發揮利福平和乙胺丁醇的作用，規范地聯合用藥，特別是對于一線藥物高度耐藥的菌株聯合二線藥物進行治療，以避免耐藥性的產生[18-19]。應加大耐藥結核特別是耐多藥結核的監控力度，繼續加強菌株培養和藥敏試驗，根據實驗結果制定合理的化療方案或調整方案[20]。對患者進行隨訪追蹤，監督指導，以提高用藥的依從性。

Ⅰ群菌株(主要流行菌株)與其它菌株對一線、二線藥物的總耐藥率、一線和二線藥物的耐藥率、單耐藥率、耐多藥率及廣泛耐多藥率進行比較，兩者間的差異無統計學意義，表明主要流行菌株與耐藥性無明顯相關性。

本實驗標本量有限，在今后的研究中，我們需不斷地加大樣本量，并且結合其它的分型方法——Spoligotyping來共同分析基因型與耐藥之間的關聯性。