尿液RBP和ALB在早期糖尿病腎病中的診斷價值及其與外周血MCP-1表達的關系

蒙軍平，張涵，趙潔，孫脊峰

隨著人口老齡化以及人們生活飲食習慣的改變，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發病率逐漸升高，DM是由于機體不同發病機制以及復合病因所引起胰島素相對或者絕對不足，從而造成患者葡萄糖、脂肪以及蛋白質發生代謝異常[1]。隨著醫療技術的發展，急性DM相關并發癥已得到一定程度的控制，患者生活質量得到提高，而以糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為代表的慢性代謝性疾病的臨床診治效果較差[2]。DN是目前臨床上最為常見的DM并發癥之一，占30%～35%，以漸進性以及慢性損傷為主要特征[3]。早期一般無典型的相關癥狀出現，可出現高血壓或者血壓無明顯變化，早期DM患者會出現腎體積增大，漸漸出現高濾過現象，進而導致微量蛋白尿以及間歇性蛋白尿的出現，另外持續性的高血壓、水腫以及蛋白尿會隨著患者病程的延長逐漸出現，從而造成腎功能不全[4]。由于DN早期無特異性癥狀，容易疏忽漏診，病情逐漸發展，危及患者生命健康，如能在其早期及時確診，并給予針對性的治療，可及時控制病情[5]。目前臨床上的DN診斷指標大都采用尿白蛋白排泄率，但由于其在糖尿病腎病早期無明顯異常表現，診斷敏感度和特異度較低，故尋找相對可靠的DN診斷指標顯得尤為重要。白蛋白(ALB)是腎小球微血管病變較為敏感的指標，可有效反映蛋白質在腎臟中的異常排泄；視黃醇結合蛋白(RBP)是反映患者腎小管損傷的敏感性指標，對早期DN的診斷具有一定臨床意義。又由于DN的發病與單核細胞超化蛋白(MCP-1)等細胞炎性因子有著密切關系，故筆者分析尿液RBP、ALB在早期糖尿病腎病中的診斷價值及與外周血MCP-1表達關系，為其臨床診斷提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年9月—2017年12月空軍軍醫大學唐都醫院腎臟內科收治的2型糖尿病患者86例作為研究對象，按照患者24 h 尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)進行分組，UAER﹤30 mg/24 h為單純DM組(46例)，30～300 mg/24 h為早期DN組(40例，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例)。單純DM組：男25例，女21例，年齡35～70(46.3±4.6)歲；平均病程(3.2±0.7)年；合并有高血壓22例，蛋白尿15例，腓腸肌痙攣10例。早期DN組：男22例，女18例，年齡36～70(45.8±5.1)歲；平均病程(3.4±0.9)年；合并有高血壓19例，蛋白尿13例，腓腸肌痙攣8例。并取同期來醫院體檢的42例健康人(口服葡萄糖耐量試驗結果正常者)作為健康對照組，其中男22例，女20例，年齡35～68(46.1±4.8)歲。3組受試者的性別、年齡等比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬同意并積極配合本研究并簽署知情協議書。

1.2 選擇標準 診斷標準：(1)2型糖尿病診斷標準[6]：符合美國糖尿病協會(ADA)于2010年制定的標準，患者空腹血糖(8 h內無熱量攝入)≥7.0 mmol/L；伴有典型的高血糖以及高血糖危象癥狀者，隨機測定血糖≥11 mmol/L；2 h耐糖試驗顯示，血糖≥11 mmol/L；糖化血紅蛋白≥6.5%者；(2)早期糖尿病腎病分期標準[5]：Ⅰ期主要以患者腎體積以及腎小球的濾過率增加為主要特征，可經過治療逐漸恢復，無相關組織病理學損傷；Ⅱ期為患者腎小球出現病理性病變，系膜區基質增多，GBM增厚，但尿白蛋白排除率正常；Ⅲ期即為早期糖尿病腎病。納入標準：(1)年齡在35～70歲，符合上述診斷標準者；(2)近期無嚴重感染者；(3)無其他相關原因造成的腎臟等相關泌尿系統疾病者；(4)無相關家族遺傳史。排除標準：(1)合并有免疫系統疾病者；(2)近期有腎毒性相關性藥物服用史者；(3)合并有心肝腎等嚴重疾病者；(4)依從性差，中途退出者。

1.3 觀測指標與方法 (1)尿液RBP、ALB測定[7]：取受試者晨尿10 ml，采用醫用離心機(河北鑫樂科技有限公司)以3 000 r/min速度離心10 min，取其上清液，采用免疫透射比濁法測定，試劑盒均購于上海北加生化試劑有限公司，操作方法嚴格按照說明書進行。陽性率判定： ALB陽性>30 mg/L，RBP陽性>50 mg/L。(2)MCP-1表達[8]：抽取受試者空腹肘靜脈血5ml置于抗凝管備用，1.25 μl被PE標記為鼠抗人MCP-1單抗(上海廣銳生物科技有限公司)和2.5 μl被PE-Cy5標記的鼠抗人CDl4單抗(上海信裕生物科技有限公司)分別加入到檢測管中，MCP-1單抗相應的鼠抗人IgG單克隆抗體(上海科敏生物科技有限公司)和2.5 μl的PE-Cy5標記的鼠抗人CDl4單抗加入到對照管中，然后分別向其中加入肝素(江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司生產)100 μl進行抗凝處理。上述樣品避光放置20 min，之后分別向其中加入溶血劑2 ml，在室溫下放置10 min，采用醫用離心機 1 500 r/min離心5 min，舍棄離心管中的上清液，向其中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml進行重懸處理，再次重復上述離心處理，之后采用上述PBS緩沖液沖洗3遍，舍棄離心管中的上清液，選用生理鹽水500 μl進行混勻，采用流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)進行MCP-1表達的測定。

2 結 果

2.1 3組尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較 患者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1水平早期DN組>單純DM組>健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 3組受試者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較

2.2 不同DN分期患者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較 患者尿液RBP、ALB及外周血MCP-1水平比較，Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3 尿液RBP、ALB及RBP+ ALB聯合診斷早期DN的ROC分析 尿RBP、ALB及RBP+ ALB聯合診斷早期DN的曲線下面積分別為0.720、0.743、0.982，同時RBP+ ALB聯合診斷、敏感度以及特異度明顯較高。見圖1、表3。

2.4 RBP、ALB以及RBP+ ALB聯合診斷的陽性率比較 RBP和ALB單獨診斷早期DN的陽性率均為67.44%(58/86)，而RBP+ALB聯合診斷的陽性率為88.37%(76/86)，三者比較差異具有統計學意義(χ2=10.944，P=0.001)。

2.5 相關性分析 糖尿病腎病患者的尿液RBP和ALB與外周血MCP-1表達均呈正相關(r=0.457、0.483，P=0.000、0.032)。

表2 不同DN分期尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較

圖1 尿RBP、ALB及聯合診斷早期DN的ROC曲線下面積

表3 尿RBP、ALB及RBP+ ALB聯合診斷的Cut-off值、敏感度以及特異度

3 討 論

糖尿病腎病具有典型的病理性變化，表現為腎小球固有細胞及細胞外基質增殖，進而形成K-W結節、腎小球硬化，腎小管不同程度損傷及間質出現不同程度的纖維化，另外在其腎小球的基底膜也會發生增厚現象[9]。由于早期的糖尿病腎病患者進行尿常規檢驗時，一般出現蛋白陰性，同時又沒有典型的臨床特征，容易出現誤診漏診現象，而一旦尿常規檢驗出現蛋白陽性，表明此時患者的腎臟已經受到了不可逆的損傷，常規血糖控制治療難以控制病情的進一步惡化[10]。所以DN的早期發現，并給予針對性的治療措施，可以及時控制病情，提高患者生存率，改善預后[11-13]。

ALB是由機體肝臟合成的一種帶有負電荷的微量蛋白，相對分子質量不小于6 900，正常情況下，由于電荷屏障分子篩的屏障作用，ALB基本上難以通過腎臟的濾過進入尿液，所以生理條件下尿液中的ALB含量很低[14]。當DM患者長期受外界各種因素的影響，造成腎臟發生一定程度的損害，腎小球濾膜的電荷屏障以及機械屏障受損，此時會有部分ALB進入腎小球的濾液中，當腎臟受損到一定程度時，腎小球濾液中的ALB含量超過其閾值時，會使患者尿液中的ALB含量增加。診斷陽性率、靈敏度較高。另外，當腎小管出現功能損傷時，即使腎小球功能正常，腎臟的重吸收功能發生障礙，也會造成尿液中ALB含量升高。再者由于DN患者一般都是長期處于低水平胰島素以及高血糖的內環境下，可以顯著降低腎臟中的硫酸肝素糖蛋白的含量，其主要存在于腎小球基底膜內外的疏松層中，從而減少負電荷含量，進而提高尿中ALB的含量[15-16]。健康人尿中ALB的含量一般不超過20 mg/L，含量20～200 mg/L即稱為ALB尿，研究顯示其可以作為早期DN的診斷指標。

本結果顯示，早期DN患者的尿ALB含量最高。RBP是由患者肝細胞內質網合成的一種親脂性蛋白質，主要分布在尿液、腦脊液以及血清中，在血液中起到一定程度的維生素轉運作用，相對分子質量在21 000左右[17]。血液中以游離狀態存在的RBP可以被機體的腎小球濾出，并很快在腎臟的近曲小管部位分解[18]。當患者腎臟的濾過功能受損，超過閾值后，尿液中RBP含量升高，可以相對靈敏地反映患者近曲小管的早期損傷[19-21]。 本結果顯示，2種指標單獨診斷DN時，其診斷準確率無明顯差異，而2種指標聯合診斷時，可以一定程度避免其他因素引起的單一ALB或者RBP水平升高所引起的漏診，可以全面的反映患者腎臟腎小管、腎小球以及近曲小管的早期損傷，診斷陽性率、靈敏度均較高。另外ROC曲線下面積越大診斷早期DN價值越大，RBP+ALB聯合診斷的敏感度以及特異度均明顯較高，故RBP+ ALB具有更好的臨床診斷價值。結果顯示，DN的發病與炎性細胞在腎組織的浸潤關系密切，而MCP-1是由成纖維細胞、單個核細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞以及腎小管上皮細胞分泌產生并在腎臟積聚活化，對DN的發生以及發展具有顯著的介導作用，可以一定程度反映患者腎臟的早期損傷[22]。故其表達與尿液RBP、ALB水平呈現正相關。

綜上所述，尿液RBP+ALB聯合診斷早期糖尿病腎病的ROC曲線下面積較大，臨床診斷價值較高，并與外周血MCP-1表達呈現正相關，可以較為靈敏地反映患者的腎功能損傷，有效地避免或者延緩糖尿病腎病的發生，提高患者的生活質量。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

蒙軍平：執筆，整理資料，分析資料；張涵：收集整理資料，分析數據，圖表設計；趙潔：收集整理資料，參考書籍查找；孫脊峰：修改總指導