TBX18腺病毒使成鼠骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞的研究

李艷君，唐艷紅，陳元秀，楊媚

干細胞特指具有自我更新和分化能力的細胞集，以干細胞為基礎的治療方法在過去15年獲得了廣泛關注[1]。骨髓腔由造血細胞及間充質干細胞等多相細胞群組成，其中，間充質干細胞(MSCs)是多能干細胞，可以在體內和體外分化成多種細胞類型，且較易從骨髓中獲取，并進行培養和擴增[2-4]。T-BOX轉錄因子在胚胎期心臟細胞特異性的形成過程中起重要作用，已有研究證實，TBX18轉錄因子能誘導乳鼠心肌細胞分化為起搏樣細胞，并特異性表達起搏細胞的特有標志物[5]。但是TBX18能否誘使成鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化為心肌樣細胞，仍未可知。本文旨在研究TBX18轉錄因子能否成功轉入BMSCs，并誘導其向心肌樣細胞分化，以期更好地指導臨床，報道如下。

1 材料與方法

本實驗于2015年5月—2016年10月在武漢大學心血管病研究所/心血管病湖北省重點實驗室進行。

1.1 材料

1.1.1 實驗動物： 成年SD大鼠，雄性，SPF級，體質量160～200 g，由武漢大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK(鄂)2014-0004]。

1.1.2 試劑： 胎牛血清(FBS)、低糖DMEM(L-DMEM)培養基(Gibco公司)，兔抗α-SMA單克隆抗體、鼠抗cTnI單克隆抗體(Abcam公司)，重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP-TBX18 和pHBAd-MCMV-GFP(上海漢恒生物科技有限公司)，Alexa Fluor 647共軛的倉鼠抗大鼠CD29抗體、PE-Cy7共軛的小鼠抗大鼠CD90抗體、FITC共軛的小鼠抗大鼠CD45抗體、Alexa Fluor 647共軛的倉鼠IgM同型抗體、PE-Cy7共軛的小鼠IgG1同型抗體、FITC共軛的小鼠IgG1同型抗體(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs分離培養及鑒定: 將大鼠麻醉，脫頸處死，用75%酒精浸泡5～10 min；于無菌操作臺中取出股骨和脛骨，PBS加2%雙抗清洗3～5次，盡量去除表面附著的軟組織。剪掉兩端干骺端，暴露骨髓腔，用5 ml注射器吸取10 %L-DMEM培養液反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白為止。將收集的懸液接種于10 cm的培養皿中，再轉移至37℃、5% CO2培養恒溫培養箱中。48 h后首次換液，以后每2～3 d換一次液，當細胞融合至80%～85%時，用0.25 %胰酶(不含EDTA)進行消化傳代。取第3～5代細胞制成1×105/L 的細胞懸液，分別加入Alexa Fluor 647共軛的倉鼠抗大鼠CD29抗體、PE-Cy7TM共軛的小鼠抗大鼠CD90抗體、FITC共軛的小鼠抗大鼠CD45抗體，同時設立相應的同型陰性對照組，即Alexa Fluor 647共軛的倉鼠IgM同型抗體、PE-Cy7TM共軛的小鼠IgG1同型抗體、FITC共軛的小鼠IgG1同型抗體，流式細胞術鑒定BMSCs表面標志物及純度，隨機數字表法分為實驗組(TBX18組)、空白病毒對照組(GFP組)和空白對照組(B組)。

1.2.2 人TBX18(hTBX18)腺病毒載體的構建及擴增： BamHI和NotI雙酶切回收腺病毒骨架載體pHBAd-MCMV-GFP，PCR擴增TBX18 ORF序列，將處理好的目的片段與載體連接，得到重組腺病毒質粒pHBAd-MCMV-GFP-TBX18。將pHBAd-MCMV-GFP-TBX18轉化DH5a感受態菌株，將轉化后的TBX18平板挑菌，提取質粒后酶切鑒定，用293細胞進行擴增，直至獲得大量純化的TBX18腺病毒載體。

1.2.3 TBX18及GFP腺病毒的轉染： 取第3～5代BMSCs接種于6孔板內，待細胞融合至50%～70%時，按感染復數即MOI=20、50、80、100分別加入TBX18或GFP重組腺病毒載體，以不含血清的L-DMEM培養基定容至1 ml，于CO2培養箱中培養。2 h后將病毒懸液吸出，再加入完全培養基2 ml，分別于 24 h及48 h后熒光顯微鏡下觀察，均以不引起明顯細胞病變效應的最大MOI值為合適的感染復數。經過不斷嘗試，確定本實驗的最適MOI=100。

1.2.4 qRT-PCR檢測α-SMA mRNA的表達： 轉病毒后1周，用Trizol試劑提取各組BMSCs的總量RNA，按逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄成cDNA，然后行熒光定量PCR (qRT-PCR)檢查，反應程序：95 ℃預變性1 min，95℃變性15 s，58 ℃退火20 s，最后72 ℃延伸20 s，共循環40次。引物序列：α-SMA：5′-GAGCACGGCATTATCACCAAC-3′，5′-CAGAACAATGCCTGT GGTTCTC-3′；GAPDH：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，5′-TTGCTGACAATC TTGAGGGA G-3′，以GAPDH作為內參，用2-△△Ct法進行定量分析。

1.2.5 Western blot檢測α-SMA和cTnI蛋白的表達： 轉病毒后1周，提取3組細胞的總蛋白，冰浴30 min，期間用移液器反復吹打，12 000 g離心5 min，收集上清液，即為總蛋白溶液。使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒來測定各孔蛋白濃度，每孔約加入蛋白40 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白后，轉到PVDF膜上，兔抗α-SMA單克隆抗體(1∶3 000)、鼠抗cTnI單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，再加入相應的HRP標記的二抗(1∶10 000)室溫下孵育30 min，TBST沖洗4次。用AlphaEaseFC 軟件處理系統分析相對應的光密度值，以GAPDH為內參作相對定量分析。

2 結 果

2.1 BMSCs的形態學特征及鑒定 細胞接種于培養皿后，呈圓形，大小不一；6～8 h后開始貼壁，呈圓形、多角形或梭形；48 h后細胞貼壁完成，呈三角形或梭形；7～10 d 形成細胞集落，呈均一的紡錘形；隨著傳代次數增加，雜細胞越來越少，骨髓干細胞越來越梭，同向排列，呈漩渦狀或放射狀。轉病毒后24 h 和48 h，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染，TBX18組和GFP組因含綠色熒光蛋白而呈綠色，BMSCs轉染效率較高，可達95%～96%(圖1見封3)。流式細胞術結果表明：培養的細胞表達干細胞標志物CD29和CD90，幾乎不表達造血干細胞標志物CD45，表明通過此法獲得的細胞是較純凈的BMSCs(97%～99%)，見圖2。

2.2 qRT-PCR檢測α-SMA mRNA的表達 轉染后1周，檢測各組α-SMA mRNA的表達，結果提示：TBX18 組的α-SMA mRNA(2.66±0.08)表達水平明顯高于GFP組(1.49±0.09)和B組(1.00±0.00)，差異均有統計學意義(t=16.743、36.813，P=0.000、0.000)，見圖3。

注：T.TBX18組；G.GFP組；B.B組。與G組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

2.3 Western blot檢測α-SMA和cTnI蛋白的表達 Western blot法檢測各組相對光密度值結果顯示：TBX18 組α-SMA蛋白的表達(0.66±0.00)明顯高于GFP組(0.36±0.08)和B組(0.17±0.03)，差異均有統計學意義(t=6.751、23.761、P=0.003、0.000)；cTnI蛋白的表達(0.57±0.12)明顯高于GFP組(0.32±0.04)和B組(0.09±0.00)，差異均有統計學意義(t=3.298、6.660、P=0.030、0.003)，見圖4。

注：T.BX18組；G.GFP組；B.B組。與G組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

3 討 論

BMSCs是骨髓中的非造血干細胞，在治療心血管疾病時，BMSCs是以細胞為基礎的再生療法的首選供體，因為這類細胞具有諸多優勢，包括易獲得，便于增殖，低免疫原性，易于導入外源基因和進行基因修飾等[6-8]。盡管目前可選的方法有很多，但移植干細胞直接分化成為心肌細胞，仍然是心臟再生治療的一大挑戰。突出強調研究這個至關重要的細胞分化過程和研發新的改善心臟再生治療方案的重要性和緊迫性[9-10]。

盡管對BMSCs的生物化學特征和免疫組織化學特征進行了眾多研究，仍然沒有重要的參數來鑒別和描述這些干細胞[11-13]。從理論上來講，這些參數應包括細胞增殖速度、免疫表型標志物、細胞活性和表型細微結構等[14]。體外用于鑒別BMSCs的方法，多采用分析細胞表面標志物的表達，如CD90、CD29、CD44和CD106，其中應用較多的當屬CD29及CD90[15]。經研究證實，CD90和CD29是干細胞的典型標志物，CD45是淋巴造血細胞的表面標志物。在本實驗中，BMSCs 的表面標志物CD90和CD29的陽性率為97%～99%，幾乎看不到CD45的表達，由此足以說明，全骨髓貼壁法可分離獲得較為純凈的BMSCs。

圖2 流式細胞術檢測BMSCs表面標志物的表達

TBX18是轉錄因子 T-box 家族中的一員，位于染色體6q14-q15，是新的祖細胞標志因子之一，也是胚胎發育期的重要轉錄因子[16-17]。TBX18在心包膜、心外膜、間充質祖細胞、竇靜脈區的分化心肌細胞中表達，可形成竇角和竇房結心肌細胞，但不形成心房和肺靜脈心肌細胞[18]。經研究證實，TBX18陽性的心外膜細胞可形成室間隔和左心室心肌細胞[19]。以TBX18為基礎的基因家族分析也表明，心外膜細胞直接形成心臟的成纖維細胞和平滑肌細胞系[20-21]。那么單一的轉錄因子TBX18能否使BMSCs分化為心肌細胞呢？基于此，本文構建了TBX18腺病毒載體，轉染成年大鼠BMSCs，經過不斷測試，確定最佳MOI=100，此時熒光表達較亮，轉染效率高，死細胞少，且將此滴度用于后續實驗，病毒轉染后再繼續培養1周，用分子生物學方法檢測心肌相關標志物的表達，即α-SMA和cTnI的表達。

Ca2+通過2種特有的調節蛋白，即肌鈣蛋白和原肌球蛋白，以調控椎橫紋肌的肌動蛋白(Tn)及肌球蛋白(Tm)的收縮，Tn和Tm均位于細肌絲[22]。其中，Tn由3個亞基組成，即肌鈣蛋白C(TnC)，肌鈣蛋白T(TnT)和肌鈣蛋白I(TnI)，cTnI在心臟中具有較高的特異性，且參與調控肌肉收縮，主要分布于骨骼肌細胞和心肌細胞中，幾乎不存在于平滑肌細胞，因此，cTnI是鑒別心肌細胞的特有蛋白[23]。α-SMA常被用作鑒別心肌細胞，兔抗α-SMA單克隆抗體是專門用來鑒別α-骨骼肌和α-心肌輔肌動蛋白，誘導分化的心肌細胞具有心臟肌小節，與α-SMA抗體起作用[24]。本結果提示：TBX18轉染誘導BMSCs形成的細胞，可表達心肌細胞的特有標志物，即α-SMA和cTnI，表明單一的轉錄因子TBX18能誘導骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞。此結果是可喜的，但轉化率依然不是很高，如何高效地誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化，依然是一個亟待解決的問題[25-26]。那么TBX18轉錄因子能否使骨髓間充質干細胞分化為起搏樣細胞呢？這也為我們下一步的研究方向提供了新的思路。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

李艷君：負責實施研究過程，撰寫論文；唐艷紅、陳元秀：論文修改、審核；楊媚：提出研究思路，指導實驗過程