美國國家家禽改良計劃標準程序（2014版）—血液檢測程序（1）

譯校│張淼潔 張倩 翟新驗（中國動物疫病預防控制中心）

譯者按：美國國家家禽改良計劃（National Poultry Improvement Plan, NPIP）于20世紀30年代初建立，是一個由行業、各州和聯邦共同合作計劃。通過該計劃，新的診斷技術可以有效地應用于改善美國的家禽和家禽產品。NPIP最初的目標是凈化美國雞群中由雞白痢沙門氏菌引起的雞白痢。該計劃后來不斷進行擴充和改進，包括了預防和控制家禽疾病的各種方案，涵蓋了傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、雞毒支原體、滑液支原體、支原體和禽流感。NPIP目前還包括商業家禽、火雞、水禽、展覽家禽、散養家禽和野禽。該計劃的參與者都是自愿的，但種雞場、孵化場和經銷商必須首先取得“雞白痢雞傷寒無疫”資格才能參加其他計劃。NPIP的技術和管理規定由行業成員和州、聯邦官員共同制定，建立了家禽在NPIP所列疾病方面無疫的評估標準，要求對滿足該計劃特定疾病控制標準的州、養殖場、孵化場、經銷商和屠宰場進行確認，并對禽群進行檢測。《國家家禽改良計劃標準程序》是NPIP實施中重要的程序文件，我們對其公開發布的2014版進行了翻譯和整理，包括血液檢測程序、細菌學檢查程序、衛生程序和分子檢查程序四個部分，供讀者借鑒。

1 標準試管凝集試驗

（a）應按照如下方式采集和運輸血樣。

（1）血液樣本應由合格的授權

人員用實驗室提供的專用容器進行采集。容器最好為3/8×3英寸（1英寸=2.54厘米）的無邊粗體試管，或小型精選藥瓶。這些試管或藥瓶必須經過徹底清潔，并在熱風干燥爐中烘干。如果用到瓶塞的話，應將瓶塞進行徹底清潔和干燥。

（2）用小而鋒利的手術刀在雞翅靜脈上切一道口子，使血液流入試管中，或直接用小型注射器抽血（用20或21號針頭）。在兩次取血之間，必須用生理鹽溶液妥善清洗注射器。為了便于分離血清，應將試管傾斜放置，直到血液凝固為止。當血液完全凝結后，應將它們打包并通過郵寄等方式送往實驗室。所有標簽必須清晰且持久，可以用合適的鉛筆在試管有刻度的一側進行標記，也可以用帶有黏性的標簽。

（3）血液樣本必須在新鮮未溶血的狀態下到達實驗室。不應接收溶血的樣本。因此，在傾斜放置試管和血液凝結后，需立即冷卻試管。若樣本不能在幾小時內到達實驗室，則將樣本包裝在加冰的專用容器中，或使用一些其他冷鏈系統，以確保樣本在運輸途中的保存。在極端寒冷的季節，必須采取極端的預防措施以防止凍結和紅細胞溶解。樣本到達實驗室后，必須立即置于冷藏（5～10℃）儲存狀態中。

（b）抗原應由具有已知抗原成分、高凝集性且對陰性和非特異性血清不敏感的雞白痢沙門氏菌代表株組成。為維持菌株的活力，每個月至少將原菌培養物轉移到新的斜面瓊脂一次，且置于溫度為18～25℃（平均室溫）的黑色柜子或箱子中保存，隨后在37℃的環境下孵育24～36小時。此外，應持續檢查原菌培養物的抗原性成分和純度。

（c）滿足培養的培養基應包含下列成分（見表1）。

表1 培養的培養基成分

（d）在用大的1英寸試管、科勒燒瓶或布萊克培養瓶盛裝的整個瓊脂表面，用從所選菌株的原種培養物配制而成的48小時斜面瓊脂培養基上培養的接種物進行劃線擴增培養。抗原培養的試管或培養瓶應放在37℃的環境中孵育48小時，用含有0.5%苯酚的0.85%鹽水溶液洗掉表面的培養物，形成重懸浮液。借助吸力的作用，使懸浮液通過布氏漏斗中的薄層脫脂棉，從而過濾掉細菌凝集塊。分離菌株的抗原應以等體積密度組合，放置在密封瓶中于冰箱中（5～10℃）保存。

（e）硫代硫酸甘油（T G）培養基也可用作制備試管凝集反應抗原的替代培養基。以前，該種培養基用于制備染色的全血抗原。這種培養基提供了一種具有高度特異性的試管抗原，極大地提高了定量的培養基中抗原的產量。硫代硫酸甘油培養基包含以下成分（表2）。

表2 硫代硫酸甘油培養基成分

在用大的1英寸試管、科勒燒瓶或布萊克培養瓶盛裝的整個瓊脂表面，用從所選菌株的原種培養物配制而成的24小時牛肉浸粉培養基上培養的接種物均勻接種涂開。抗原培養的試管或培養瓶應放在37℃的環境中孵育96小時，用含有0.5%苯酚的0.85%鹽水溶液洗掉表面培養，形成重懸浮液。借助吸力的作用，使懸浮液通過布氏漏斗中的薄層脫脂棉，從而過濾掉細菌凝集硬塊。需對抗原進行離心處理。應該從離心管或碗中去掉細菌凝集硬塊，并使其重新懸浮在含有0.5%苯酚的0.85%鹽水溶液中。細菌凝集硬塊在稀釋液中均勻懸浮后，應再次在沒有吸力的作用下，通過布氏漏斗中的棉墊進行過濾。分離菌株的抗原應以等體積密度組合，放置在密封瓶中于冰箱中（5～10℃）保存。

（f）用于常規檢測的稀釋抗原應該用抗原原液進行配制，即用含0.25%苯酚的0.85%生理鹽水溶液將抗原原液稀釋至麥氏比濁管上對應0.75～1.00的濃度。應通過加入稀釋的氫氧化鈉，將稀釋抗原的氫離子濃度調整到pH8.2～8.5。每天都應配備新的稀釋抗原，且保存在冷藏環境中。使用時，在4*1/2英寸的試管中加入2毫升稀釋抗原，或在更小的試管中加入1毫升稀釋抗原，用于制備和孵育最終的血清抗原混合溶液。可通過長滴管或特殊的充填器來完成試管中的抗原分裝。

（g）雞的最大血清稀釋度不得超過1∶50，火雞不得超過1∶25。現有數據表明，1∶25的稀釋度最有效。在所有關于血液檢測的官方報告中，都應列明血清稀釋度。需用清潔干凈的血清移液管或專用血清轉移裝置取適量的血清到凝集管中，避免混入其他血清。孵育前，應將抗原和血清充分混勻。混勻后，血清和抗原混合物必須在37℃的環境中至少孵育20小時。

（h）檢測結果記錄方式：當血清抗原混合物呈均勻渾濁狀態時，記錄N或-（陰性）；當出現明顯的抗原結塊，且凝集顆粒之間的液體呈清澈狀態時，記錄P或+（陽性）；當只有部分發生凝集反應，或凝集不徹底時，記錄S或？（可疑）；當原始記錄表中列舉出的樣本丟失時，記錄M或遺失。當血液樣本發生溶血，且無法進行檢測時，記錄H或發生溶血；當采樣管破裂，無法獲得血清時，記錄B或破損。（必須始終考慮到不同抗原和不同裝置靈敏度的差異，獨立做出判斷。同時，需要考慮到禽群的歷史。當禽群中某些個體出現可疑的凝聚反應時，最好對有代表性的家禽進行細菌學檢查，從而確定是否存在雞白痢沙門氏菌）。

2 快速血清檢測試驗

（a）在快速血清檢測中，血液樣本的采集和運輸程序與標準試管凝集試驗所述標準相同。

（b）雞白痢沙門氏菌合適菌株的選擇和維持以及理想的培養基成分已經在1（b）和1（c）描述過了。

（c）用從所選菌株的原種培養基配制而成的48小時斜面瓊脂培養基上培養的接種物，在大的1英寸試管、科勒燒瓶或布萊克培養瓶上進行劃線培養。

（d）用試管或瓶子盛裝的抗原需在37℃的環境中孵育48小時，且應以少量的含0.25%～0.5%苯酚的濃度為12%的氯化鈉溶液進行洗滌，并通過松散放置在無菌漏斗頂部的消毒脫脂棉進行過濾。

（e）應使用含0.25%～0.5%苯酚的濃度為12%的氯化鈉稀釋洗滌液，使其渾濁度比麥氏比濁管中，0.75號麥氏管的濃度高出50倍或在蓋茨濁度計上的讀數為7毫米。

（f）針對單個菌株抗原，需要與已知合適的抗原進行比較，用陰性血清檢測其不靈敏性，用陽性血清檢測其高凝集性。分離菌株的抗原應以同等體積密度組合，放置在密封瓶中于冰箱中（5～10℃）保存。

（g）該檢測試驗應在合適的光滑平板上進行。與標準試管凝集試驗相比，血清抗原的稀釋度不得超過1∶50。在檢測火雞血液樣本時，最好同試管凝集試驗方法一樣，血清抗原的稀釋度為1∶25。將血清加入到抗原中時，應用血清移液管的尖端進行充分攪拌。大多數強陽性反應會在15～20秒鐘內就會出現明顯的結果，最終的結果應在2～3分鐘后讀取。在大約37℃的環境下加熱平板可以加速凝集反應。在讀取結果前，應轉動平板數次。

（h）應按照1（h）中的規則記錄檢測結果。

3 染色抗原快速全血檢測試驗

（a）此處沒有提到抗原的制備方法，因為該抗原是一種專利產品，只有在獲得農業部許可的情況下才能生產該種產品。

（b）通常可以從抗原制造商那里獲取一個用于測量正確血液量的閉環。理想的閉環是用一根21/2英寸長的20號測量用鎳鉻合金線制成，環的末端被塑造成直徑達十六分之三英寸的小環。當該環中充滿血液時，血液看上去會凸起，能夠盛滿0.02毫升的血液。用滴管頭能調為盛裝0.05毫升液體的醫藥用滴管來量取抗原。經證實，一個約15英寸平方的能夠提供48個檢測空間玻璃板，適合做這項試驗。使用這樣一個玻璃板能夠使測試者能夠同時觀察一系列連續的試驗混合物，而不用停止工作，等待結果，然后才開始檢查下一只家禽。

（c）應在測試玻璃板上滴一滴抗原，應從翅靜脈中取一個鉑環量的血液。將閉環浸沒在血液中，然后小心地取出，閉環就會被填滿。俯視該充滿血液的閉環邊沿時，可以觀察到血液似乎凸起。隨后，應將該圈血和該滴抗原進行攪拌，混合液將擴散至直徑約1英寸。隨后，需用清水沖洗該閉環，如果必要的話，用一張干凈的吸墨紙將其擦干。應從一側到另一側晃動檢測板幾次，使抗原和血液充分混合，并加速凝集。抗原的使用應遵照生產商的指示。

（d）與其他凝集檢測一樣，檢測人員在本試驗中會觀察到不同程度的反應。血液的凝集能力越強，凝集速度越快，凝塊面積越大。在陽性反應中，可以明顯觀察到抗原凝塊，且周圍可見清晰的間隙。這種反應在白色背景下很容易觀察到。在稍微較弱的陽性反應中，可以觀察到細小但仍清晰可見的抗原凝塊，且周圍的間隙只是部分清晰。在這種狀態和陰性或同種類涂片中，有時候會出現一個肉眼幾乎看不到的微小粒狀物，診斷病情時應忽視這一點。在涂片變干前發生的極其細微的邊緣凝集反應也被視為陰性。在陰性反應中，涂片中的液體依然保持均勻（應考慮到不同抗原和試驗設備在靈敏度方面的差異，做出獨立的判斷）。此外，還需考慮到禽群的歷史。當禽群中一些禽出現可疑的凝集現象時，需要選擇有代表性的禽只進行細菌學檢查，以判斷其是否存在雞白痢沙門氏菌感染。

4 雞白痢雞傷寒微量凝集試驗

按常規，微量凝集試驗是一種單次稀釋試驗，在反應18～24小時后讀取一個數值。

（a）在微量凝集檢測中的采集和運輸血液樣本的程序與部分標準試管凝集試驗中描述的程序相同。一個經證明更有效的方法是從血凝塊中將血清標本轉移到微孔板上，再根據本部分（d）或（e）段落進行稀釋。

（b）針對雞白痢雞傷寒微量凝集試驗的染色抗原是以濃縮原液懸浮液的形式提供，且必須經農業部批準。抗原的稀釋需遵守官方指示。每天制備的原液和稀釋抗原不用時，需放在5～10℃的環境中密封避光保存。

（c）現有數據表明，微量凝集試驗中，最能有效檢測出雞和火雞體內雞白痢雞傷寒凝集素的稀釋比例為1∶40。所有關于血液檢測試驗的官方報告均需列出血清稀釋度。

（d）血清稀釋度為1∶40的微量凝集試驗的推薦操作程序如下。

（1）向微孔板的每個孔中加入100微升（0.10毫升）濃度為0.85%的生理鹽水。

（2）用單道微量稀釋器或裝有12個10微升微量稀釋器的多道微量稀釋器，向微孔板的對應孔中加入來自采集樣本的5微升（0.005毫升）血清樣本。具體操作是用微量稀釋器輕觸血清樣本表面，然后將其轉移到微孔板中，與微孔板中的稀釋液充分混合。微量稀釋器使用后應移開、吸干液體、接觸蒸餾洗滌水表面、然后再擦干。

（3）用含0.50%苯酚的鹽水稀釋微量試驗抗原，在微孔板中加入100微升（0.1毫升）抗原。

（4）正如1972年5月《應用微生物學》所描述的，用塑料封板膜將每個微孔板密封，或直接將其放入密封的孵化箱，在37℃的環境中孵育18～24小時。

（5）按照本節（f）段落中的描述讀取測試結果。

（e）微量凝集試驗稀釋的推薦程序如下：

（1）向微孔板的每個孔中加入50微升（0.05毫升）濃度為0.85%的生理鹽水。

（2）在稀釋過程中，向最低稀釋度的孔中額外加入50微升（0.05毫升）濃度為0.85%的生理鹽水，使這些孔中的液體量達到100微升。

（3）按照本標準本部分（4）、（d）（2）所述的方法，將每個血清樣本加入到第1個含100微升（0.10毫升）的孔中，代表最低稀釋度。

（4）用裝有12個50微升微量稀釋器的多道微量稀釋器，通過將50微升（0.05毫升）的稀釋血清從一個孔轉移到下一個孔中，進行血清連續2倍稀釋。完成所有孔的連續稀釋后，將留在微量稀釋器中的50微升液體棄去，用微量稀釋器輕觸蒸餾洗滌水表面，然后再擦干。

（5）用含有0.50%苯酚的鹽水稀釋微量凝集試驗抗原，然后向每一個微孔板加入50微升（0.05毫升）抗原。

（6）用塑料封板膜將每一個微孔板密封，或直接將其放入密封的孵化箱，在37℃的環境中孵育18～24小時。

（7）按照本部分（f）段落中的描述讀取測試結果。

（f）借助讀數鏡來讀取測試結果。測試結果解釋如下：

（1）當微孔板的孔中出現一個大而明顯的紐扣狀染色抗原時，記錄為N或 - （陰性）。

（2）當微孔板的孔沒有出現紐扣狀抗原時，記錄為P,或+（陽性）。

（3）當微孔板的孔中出現一個小的紐扣狀抗原凝集時，記錄為S,或？ （可疑）。可疑反應可能更傾向于陽性而非陰性[±]。