鋅摻雜碳量子點“關-開”型熒光探針檢測果蔬中谷胱甘肽的研究

李 宏,華建豪,侯朝祥,王翰墨,田 浩,楊亞玲,李晚誼*

(1.云南省農業科學院 農產品加工研究所,云南 昆明 650033；2.昆明理工大學 生命科學與技術學院,云南 昆明 650500)

谷胱甘肽是一種特殊的氨基酸衍生物,由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸3種氨基酸組成,在自然界中以還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形式廣泛存在于動植物和微生物體內,還原型為其主要存在形式[1]。GSH分子內含有活性巰基,具有保護肝臟、抗病毒、解毒、抗腫瘤作用,在細胞的多種基本代謝功能中起抗氧化作用[2]。目前,測定谷胱甘肽的常用方法有：高效液相色譜法[3]、毛細管電泳法[4]、分光光度法[5]、電化學法[6]、酶法[7]等。這些方法各有優點,但存在操作繁瑣,耗時等不足。熒光分析方法因靈敏度高、快速、簡便、經濟,在諸多分析方法中占有優勢,尤其是基于發光碳量子點的熒光分析方法,已發展成為一種新型有效的方法[8]。

熒光碳量子點(CQDs)是一種尺寸在10 nm 以內且單分散的準球形新型熒光納米材料,是目前最熱門的碳納米材料之一。與傳統的有機熒光染料相比,CQDs具有優異的生物相容性,綠色環保性,親水性,化學及光穩定性等諸多優點,是一種理想的分析探針[9-10]。此外,研究發現,通過化學摻雜能完善CQDs的缺陷從而提高其各方面的性能[11-12]。目前,基于碳量子點的熒光響應分析已應用于無機金屬離子[13]和有機物[14]的定量測定。

本研究從碳量子點(CQDs)熒光猝滅-恢復現象出發,以檸檬酸、乙二胺和乙酸鋅為前體,采用一步水熱法制備了一種穩定的、高熒光量子產率的藍色發光鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs)。在合成的碳量子點中加入Cu2+使其熒光猝滅,再在體系中加入GSH,由于Cu2+-GSH的螯合作用,體系的熒光恢復,進而可實現對GSH的選擇性檢測。本方法操作簡單,靈敏度高,成本低,可用于果蔬樣品中GSH的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

G9800A熒光分光光度計(美國安捷倫公司),Tecnai G2 TF30場發射透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司),X射線衍射儀(XRD,德國Bruker公司),TENSOR27型傅立葉紅外光譜分析儀(德國Bruker公司),UV-2600紫外-可見分光光度計(日本島津公司),XW-800快速混勻器(上海汗諾儀器有限公司),HC-3018R型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司),120 mL聚四氟乙烯(PTFE)內襯水熱反應釜(上海一凱實驗儀器有限公司),電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

還原型谷胱甘肽、乙酸鋅、三氯乙酸、維生素C、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺均購自阿拉丁化學試劑有限公司,葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、乙二胺、磷酸氫二鈉購于國藥集團化學試劑有限公司,CuCl2、NaCl、MgCl2、CaCl2、ZnCl2、KI、FeCl3·6H2O購自天津市化學試劑三廠。所用化學藥品及試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

GSH提取液的配制：準確稱取5.0 g三氯乙酸,溶解于純水中并定容至50 mL,配制成質量濃度為0.1 g/mL的提取液備用。

1.2 實驗方法

1.2.1鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs)的制備分別準確稱取1.0 g的檸檬酸,0.5 g的乙酸鋅溶于100 mL超純水中,超聲10 min使其混合均勻,再加入5 mL乙二胺,室溫下攪拌均勻后將溶液轉移至聚四氟乙烯內襯水熱反應釜中,于180 ℃恒溫加熱6 h,反應完成后自然冷卻至室溫,得棕色溶液。將所得溶液過0.22 μm濾膜以除去大顆粒雜質,再經10 000 r/min高速離心15 min,得到鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs),并于4 ℃下儲存備用。

1.2.2量子產率的測定將碳量子點配制成溶液后,測試其紫外可見吸收光譜及熒光光譜(λex=350 nm)。將熒光峰的積分面積F及相應的吸收值A(λem=440 nm)代入公式：

Φx=ΦS(nx/nS)2(AS/Ax)(Fx/FS)

(1)

式中,Φx為測試樣品的熒光量子效率,ΦS表示標準物質的熒光量子效率,n表示溶劑的折光指數。實驗中采用的標準物(S)為硫酸奎寧(熒光量子效率為54%)。計算得到熒光量子點產率為37.68%。

1.2.3樣品處理本實驗所用果蔬樣品均購于當地超市(云南昆明)。分別準確稱取洗凈的黃瓜和西紅柿樣品各10 g,充分研磨,勻漿,分別加入10 mL GSH提取液,充分振蕩10 min使提取完全,提取液經8 000 r/min 離心10 min后過0.22 μm濾膜,得到的上清液用純水定容至50 mL,待測。

1.2.4測定方法向3 mL的Zn-CQDs(0.5 g/L)溶液中加入1 mL的Cu2+(5 mmol/L)溶液,用pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L)定容至50 mL,靜置10 min備用。

稱取適量GSH,用超純水溶解,配制成不同濃度系列的GSH溶液。取上述經Cu2+猝滅的Zn-CQDs溶液1.0 mL,加入不同濃度的GSH儲備液100 μL,用pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L)定容至3 mL,渦旋混勻。于激發波長λex=348 nm,發射波長λem=445 nm處測定熒光強度F和試劑空白溶液熒光強度F0。實驗過程示意圖如圖1所示。

圖1 鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs)的制備及檢測GSH的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation of zinc-doped carbon quantum dots (Zn-CQDs) and their application for GSH detection

2 結果與討論

2.1 碳量子點的合成與表征

本實驗通過一步水熱法制備了Zn-CQDs。以乙酸鋅作為鋅摻雜的反應前體可提高熒光量子產率,同時改變Zn-CQDs的電負性提高選擇性[15]。如圖2A所示,與不摻鋅的CQDs相比,Zn-CQDs的發射光譜出現紅移,且量子產率提高9.68%,證明了Zn-CQDs的合成以及鋅摻雜的改性作用。

圖2B為Zn-CQDs的透射電鏡圖(TEM),從圖中可以看出,所制備的碳量子點呈類球形結構,分散性好,且尺寸均一,平均尺寸4～5 nm左右。從高倍透射電鏡(插圖)圖可以看出,Zn-CQDs的晶格間距約為0.21 nm,對應于石墨的(102)晶面[16]。Zn-CQDs的X射線衍射譜圖在2θ=23.2°處出現一個較寬的衍射峰(圖2C),歸為碳的特征衍射峰,說明Zn-CQDs具有一定的晶型結構。

2.2 測定原理

由于Zn-CQDs表面含有大量的羧基和氨基基團,能與Cu2+通過靜電作用結合并附著于Zn-CQDs表面,當Zn-CQDs處于激發態時,Cu2+直接從光激發碳量子點的導帶吸收電子并轉移至未占有電子能級的最低軌道上,從而導致激發態電子不能有效回到價帶,即發生電荷轉移而使Zn-CQDs熒光猝滅。向該猝滅體系中加入GSH時,由于GSH分子內的巰基和羰基只與Cu2+結合形成螯合物,且結合鍵的強度大于靜電作用力的強度,因此Cu2+會逐漸從Zn-CQDs表面脫離[17],使得體系的熒光逐漸恢復(圖1)。

圖4 pH值對體系熒光強度的影響Fig.4 Effect of pH value on the fluorescence intensity of the system

2.3 反應條件的優化

2.3.1pH值本實驗選用50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液作為緩沖體系,考察了緩沖溶液pH值的影響。在pH 2.0～8.0范圍內,不同緩沖溶液pH值對熒光猝滅及恢復體系熒光強度的影響見圖4。在熒光猝滅及恢復體系中,當pH≤6.0時,熒光強度變化值隨pH值的增加不斷增加,當pH>6.0后,熒光強度變化值逐漸變小,故本實驗選擇磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的最佳反應pH值為6.0。當反應體系定容至3.0 mL時,緩沖液用量為1.9 mL。

2.3.2反應時間研究了反應時間對熒光恢復體系的影響。在1～10 min范圍內每隔1 min測定1次體系熒光強度變化值,發現體系熒光強度變化值在1～5 min內逐漸增加,隨后趨于穩定,故選擇5 min為最佳反應時間。

2.4 猝滅體系對GSH的選擇性

2.5 猝滅體系對GSH的響應

在優化實驗條件下,考察了猝滅后的Zn-CQDs熒光恢復程度與GSH濃度之間的關系。發現GSH濃度在0.05～80 μmol/L內與Zn-CQDs熒光恢復率呈線性關系,線性回歸方程為y=0.053 6x+0.340 4,其中,y表示熒光恢復率(F-F0)/F0,x表示GSH的濃度,相關系數r2=0.996 4,檢出限達63 nmol/L(S/N=3),且GSH濃度的變化對Zn-CQDs+Cu2+的熒光光譜幾乎無影響。相比于GSH的其他檢測方法(表1),本方法通過熒光探針的“關-開”模式對GSH進行選擇性識別,具有線性范圍寬、檢出限低的優勢,靈敏度和檢測效率較高。

(續表1)

MethodSampleLinear rangeLODReferenceColorimetryA549 cells3.0～30 μmol/L-[7]FluorescenceTomatoes and cucumbers0.05～80 μmol/L63 nmol/LThis work

2.6 實際樣品分析

取西紅柿和黃瓜樣品,按上述方法各平行測定5次,得到西紅柿和黃瓜提取液中GSH的平均含量分別為5.3 μmol/L和6.1 μmol/L。對樣品進行1.0、20.0 μmol/L兩個水平的加標實驗,每個水平平行測定5次,得到加標回收率為98.6%～101%,相對標準偏差為1.8%～3.1%(n=5),結果見表2。說明本方法具有良好的回收率和精密度。

表2 實際樣品中谷胱甘肽含量的測定結果(n=5)Table 2 Determination results of GSH in practical samples(n=5)

3 結 論

本研究制備了一種高穩定性、高熒光量子產率的水溶性鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs),利用Cu2+對碳量子點的光致電子轉移猝滅及GSH-Cu2+之間的螯合作用,建立了碳量子點熒光猝滅-恢復效應測定谷胱甘肽的新方法,實現了對果蔬中谷胱甘肽的靈敏檢測。在最優條件下,方法的線性范圍為0.05～80 μmol/L(r2=0.996 4),檢出限達63 nmol/L。該分析方法專屬性強、靈敏度高、操作簡便,檢測時間短,在谷胱甘肽的檢測方面具有較為廣闊的應用前景。