液相色譜-串聯質譜法測定水產品中亮綠、亞甲基藍及其代謝物殘留量

余瑋玥，黃冬梅，史永富，孔 聰，田良良，韓 峰，張政權

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院 東海水產研究所農業部遠洋與極地漁業創新重點實驗室，上海 200090)

亮綠(Brilliant green,BG)屬于三苯甲烷類染料，與孔雀石綠的分子結構式相似。亞甲基藍(Methylene blue，MB) 又名次甲基藍、堿性湖藍，屬于人工合成的噻嗪類染料，最早應用于治療細菌性痢疾[1]。孔雀石綠因具有高毒、高殘留以及致癌、致突變等特點[2]，已被許多國家禁止在水產養殖中使用，而有些養殖戶將亮綠及亞甲基藍作為替代品使用。亮綠具有抗微生物、抗寄生蟲和抗真菌特性，但同時也有一定的毒性，具有致突變和致癌作用，會影響水生生物和人類的健康[3-4]。亞甲基藍在水產養殖中可用于治療淡水魚類的小爪蟲病、紅嘴病、斜管蟲病等，也可用作消毒劑降低存養池中的微生物量[5]。亞甲基藍在生物體中經過代謝，分子結構發生變化，其代謝產物分別為天青A(Azure A，AZA)、天青B(Azure B，AZB)和天青C(Azure C，AZC)。高濃度的亞甲基藍對水生生物有毒性甚至致其死亡[6]，并會通過食物富集作用對人體造成危害，因此需要建立水產品中亮綠、亞甲基藍及其代謝物殘留量的檢測方法。

近年來，國內外對亮綠、亞甲基藍及其代謝物殘留的檢測方法有分光光度法[7-8]、毛細管電泳法[9-10]、電化學法[11-12]、液相色譜法[13-14]以及液相色譜-串聯質譜法[15-17]等。其中液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法應用較多，但液相色譜法可能因樣品中干擾物質的存在導致定性不準確，而液相色譜-串聯質譜法檢測器的靈敏度較高，能提供豐富的結構信息，可通過母離子、子離子等信息進行確證，從而提高了檢測的準確性[18]。目前同時檢測亮綠、亞甲基藍及其代謝物的方法報道較少，且尚未建立水產品中亮綠、天青A、天青B和天青C同時檢測的國家標準方法。侯建波等[15]采用液相色譜-串聯質譜法對亮綠、亞甲基藍及其代謝物進行同時測定，以MCAX柱凈化，需使用2種洗脫液，洗脫過程繁瑣且前處理時間長。惠蕓華等[19]采用高效液相色譜-串聯質譜法測定孔雀石綠、結晶紫、亞甲基藍等6種陽離子染料，但未檢測亮綠及亞甲基藍代謝物。Tarbin等[20]采用液相色譜-串聯質譜法對亮綠、亞甲基藍及天青B進行檢測，檢出限分別為1.1、14.0、6.2 μg/kg。本實驗建立了水產品中亮綠、亞甲基藍及其代謝物同時檢測的方法，采用PRS固相萃取柱，僅用1種洗脫液即可完全洗脫目標物，有效縮短了前處理時間，且靈敏度較好，適用性強，能滿足水產品中藥物殘留的檢測要求，為制定水產品中亮綠、亞甲基藍及其代謝物殘留量的測定標準奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜儀(美國Thermo Fisher 公司)；16RⅫ 高速冷凍離心機(日本 Hitachi CF公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore 公司)；VisiprepTMDL固相萃取裝置(美國Supelco公司)；BT 423S電子精密天平(Sartorius公司)；Genius 3 旋渦混合器(德國 IKA 公司)；KQ-300E超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；V-700 旋轉蒸發器(瑞士Buchi公司)；N-EVAPTM112型氮吹儀(美國Organomation公司)；ST3100 pH計(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；Bond Elut PRS固相萃取柱(500 mg/3 mL，美國Agilent 公司)。

亮綠(純度96%，德國Dr.Ehrensorfer公司)；亞甲基藍(98%，美國Fluka公司)；天青A(80%)、天青C(50%)(山東西亞化學工業有限公司)；天青B(98%，美國Sigma公司)；乙腈、甲醇、二氯甲烷(J.T.Baker公司)，甲酸(Fluka公司)，乙酸銨(Aladdin公司)均為HPLC級；鹽酸羥胺、對甲苯磺酸、二甘醇均為分析純；洗脫液為0.1 mol/L乙酸銨(pH 4.5)-乙腈(1∶1，體積比)。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：稱取亮綠、亞甲基藍、天青A、天青B、天青C標準品各10.0 mg(精確至0.000 1 g)，分別用甲醇溶解，并定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L 的單標儲備液，于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存，有效期6個月。

混合標準中間液：分別準確移取適量100 mg/L單標儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成亮綠、亞甲基藍、天青A、天青B、天青C均為1 mg/L的混合標準溶液，于4 ℃棕色玻璃瓶中保存，有效期3個月。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取稱取2.0 g試樣(精確至0.01 g)于30 mL塑料離心管中，加入250 g/L鹽酸羥胺 1 mL、0.5 mol/L對甲苯磺酸 2.5 mL、0.1 mol/L乙酸銨(pH 4.5)5 mL和乙腈10 mL，渦旋混勻1 min，50 ℃下超聲提取15 min。于5 ℃下高速離心(10 000 r/min)10 min，移取上清液至50 mL塑料離心管中，殘渣再用10 mL乙腈重復提取1次，合并上清液，混勻，待凈化。

1.3.2凈化向塑料離心管中加入2 mL二甘醇和20 mL二氯甲烷，渦旋混勻1 min，靜置30 min，6 000 r/min離心10 min，下層溶液轉移至50 mL雞心瓶中，上層溶液中加入5 mL乙腈和15 mL二氯甲烷進行萃取，合并下層溶液，濃縮至2 mL左右。加入5 mL乙腈溶解，渦旋混勻1 min，超聲5 min。將溶液過經5 mL乙腈活化的PRS固相萃取柱，以2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗并減壓抽干，加入5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液于40 ℃下氮吹至3 mL(若低于3 mL，則用乙腈定容至3 mL)，過0.22 μm濾膜后，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18柱(2.0 mm×100 mm，3 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，B為乙腈，C為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.0 min，80%A，10%B；1.0～8.0 min，80%～5%A，10%～45%B；8.0～10.0 min，5%A，45%B；10.0～10.1 min，5%～80%A，45%～10%B；10.1～14.0 min，80%A，10%B。

1.5 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：選擇反應監測模式(SRM)；掃描方式：正離子模式；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣壓力：20 kPa；輔助氣壓力：10 kPa；離子傳輸毛細管溫度：320 ℃。亮綠、亞甲基藍及其代謝物的母離子、子離子和碰撞能量見表1。

表1 亮綠、亞甲基藍及其代謝物的質譜分析參數Table 1 Mass spectrometric parameters of brilliant green,methylene blue and its metabolites

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1色譜柱的選擇文獻顯示[19,21]，C18填料的色譜柱可對亮綠、亞甲基藍、天青A、天青B和天青C進行有效分離。實驗對比了粒徑分別為3 μm和5 μm的CAPCELL PAK C18色譜柱，結果發現粒徑為3 μm的色譜柱柱效高于5 μm色譜柱，天青C在粒徑為5 μm的色譜柱上出峰時間為3.87 min，比3 μm色譜柱上的出峰時間提前1 min左右，且目標峰附近有干擾。因此，選擇粒徑為3 μm的CAPCELL PAK C18柱，可實現5種化合物的良好分離。

2.1.2流動相的優化對水產品中漁藥、獸藥殘留進行檢測時，一般選用乙腈、甲醇和水作為流動相，并在流動相中加入甲酸提高離子化效率,加入乙酸銨改善峰形、減少拖尾[22]。分別考察了0.1%甲酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈和2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈-甲醇3種流動相的分離效果，發現以0.1%甲酸-乙腈或2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈為流動相時，天青C的峰形不穩定且拖尾嚴重。甲醇因極性較大可將目標物更好地從色譜柱上洗脫，因此流動相中加入甲醇后天青C的峰形得到改善，其余4種目標化合物均能較好分離且峰形尖銳。圖1為最優條件下亮綠、亞甲基藍及其代謝物的提取離子流圖。

圖2 不同提取溶劑對5種化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recoveries of five compounds

2.2 樣品前處理方法的優化

2.2.1提取溶劑與萃取溶劑的選擇亮綠、亞甲基藍及其代謝物易溶于乙腈、甲醇、水等溶液，而水產品的基質復雜，含有大量脂肪和蛋白質，由于乙腈具有沉淀蛋白的作用[23]，因此選擇乙腈作為主要的提取溶劑。考察了乙腈、乙腈-乙酸乙酯、乙腈-二氯甲烷、乙腈-乙酸銨緩沖溶液(鹽酸羥胺、對甲苯磺酸和乙酸銨溶液)的提取效果(圖2)，發現以乙腈、乙腈-乙酸乙酯或乙腈-二氯甲烷為提取溶劑時，亮綠和天青C的回收率僅為50%左右，而用乙腈-乙酸銨緩沖溶液提取可有效提高回收率。這是因為提取溶劑中加入鹽酸羥胺可防止目標物被氧化[24]。此外，由于5種化合物均為陽離子型化合物，選擇對甲苯磺酸作為離子對試劑，在酸性環境下可與目標物形成離子對，使其更易被有機試劑提取[25]。因此，最終選擇乙腈-乙酸銨緩沖溶液作為提取溶劑。

為更有效去除水產品中的雜質，本實驗采用二氯甲烷作為萃取溶劑進行液液萃取凈化，利用化合物在兩種互不相溶(或微溶)的溶劑中溶解度或分配系數的差異，使化合物從一種溶劑轉移到另一種溶劑中。實驗中加入乳化劑二甘醇，可使水相和有機相混合均勻，有利于二氯甲烷將水中的乙腈萃取完全，在旋蒸過程中也可防止爆沸[26]。此外，進行第二次反萃取時加入乙腈作為介質可提高萃取效率[13]。

2.2.2固相萃取柱的選擇亮綠、亞甲基藍及其代謝物均為陽離子型化合物，因此考察了N-丙基乙二胺固相萃取柱(PSA)、HLB柱和丙磺酸固相萃取柱(PRS)對目標物的吸附和凈化作用。結果表明，通過型萃取柱PSA柱對天青C的吸附較大，回收率為60%左右，其余目標化合物的回收率為77.1%～87.1%；HLB柱采用乙酸銨上樣，甲醇洗脫，天青C的回收率僅為40%左右，其他目標化合物的回收率為75.9%～96.2%，并且HLB柱對雜質的凈化效果差，樣液較渾濁；而PRS柱是以硅膠為基質的強陽離子交換萃取柱，鍵合官能團為丙基磺酸，其不僅能將5種目標化合物吸附，并且采用乙腈-0.1 mol/L乙酸銨(pH 4.5，1∶1)混合溶液能將其完全洗脫，回收率均在90%以上，且凈化后溶液澄清。因此實驗選用PRS柱進行固相萃取。

實驗對洗脫液用量(2、3、5 mL)進行了優化，結果發現洗脫液用量少時不能將目標物完全洗脫。洗脫液用量為3 mL時，亞甲基藍的回收率僅為35.6%；洗脫液用量為5 mL時可將所有化合物完全洗脫，且回收率均高于90%，因此選擇洗脫液用量為5 mL。

2.2.3濃縮體積的優化試驗過程中，萃取所得溶液需要旋蒸濃縮，但旋蒸至干時某些化合物有損失，亮綠、天青A和天青C的回收率分別為69.5%、52.2%和79.2%，因此選擇將溶液旋蒸至約2 mL，以減少損失。收集的固相萃取柱洗脫液氮吹濃縮時也會導致損失，天青A和天青B的回收率僅分別為46.3%、52.9%，考慮到洗脫液中有水分較難吹干，因此最終選擇氮吹濃縮至3 mL。

2.3 基質效應的研究

基質效應是樣品基質中含有的內源性化合物影響液相色譜-串聯質譜信號強度的現象[27]。其計算公式為：基質效應=(1-基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率)×100%[28]。結果表明，樣品基質對5種目標物的基質效應為40.1%～75.3%。由于存在基質抑制效應，因此本實驗采用空白基質溶液配制標準曲線以減少基質干擾，提高樣品定量結果的準確性。

2.4 方法有效性評價

2.4.1線性范圍、檢出限及定量下限以空白基質溶液配制1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L的混合標準工作溶液，采用本方法進行分析，以標準溶液的質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，各化合物定量離子的色譜峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。選取空白鯽魚作為樣品基質進行加標實驗，加標水平為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/kg，按照本方法提取凈化后進行分析，以不低于3倍信噪比(S/N≥3)且滿足方法準確度要求時對應的目標物濃度為檢出限(LOD)，以S/N≥10對應的濃度為定量下限(LOQ)[29]。亮綠、亞甲基藍及其代謝物在1.0～100.0 μg/L范圍內呈良好的線性關系(r2>0.999)，LOD均為1.0 μg/kg，LOQ均為2.0 μg/kg(表2)。

2.4.2回收率與相對標準偏差以陰性鯽魚為樣品進行加標回收實驗，加標水平為1.0、5.0、10.0 μg/kg，每個加標濃度平行測定6次，計算回收率及批內相對標準偏差(RSD)。亮綠、亞甲基藍及其代謝物的平均回收率為70.3%～92.1%，RSD為2.3%～13%(表2)。本方法的準確度和精密度能夠滿足微量分析的要求。

表2 亮綠、亞甲基藍及其代謝物的線性范圍、方法檢出限、定量下限、回收率和相對標準偏差Table 2 Linear ranges,LODs,LOQs,recoveries and relative standard deviations of brilliant green,methylene blue and their metabolites

2.5 實際樣品的檢測

將已建立的方法應用于實際樣品的檢測，在上海江楊農產品批發市場抽取的鯽魚、大黃魚、南美白對蝦和大閘蟹24個樣品中均未檢出目標化合物。另采用該方法對本課題組開展的藥代實驗中取得的陽性樣品進行測定，以200 μg/L的亮綠溶液對體重為200～300 g的鯽魚進行藥浴實驗。于不同時間收集鯽魚樣品，每個時間點取3條鯽魚，利用本方法進行檢測。某時間點測得3條鯽魚肌肉中亮綠的含量分別為31.3、35.9、30.3 μg/kg，其他實驗室采用本方法對該樣品的檢測結果分別為30.5、34.7、29.3 μg/kg，與本實驗室測定結果較一致。

3 結 論

本文利用液相色譜-串聯質譜建立了水產品中亮綠、亞甲基藍及其代謝物殘留的同時檢測方法，通過使目標化合物形成離子對提高了提取效率，采用二氯甲烷液液萃取和PRS固相萃取柱相結合的方法凈化樣品，有效去除了雜質，降低了干擾。在最佳實驗條件下，5種化合物在1.0～100.0 μg/L范圍內線性關系良好，檢出限均為1.0 μg/kg，定量下限均為2.0 μg/kg；回收率為70.3%～92.1%，RSD為2.3%～13%。將該方法應用于藥代實驗中實際陽性樣品的檢測，與其他實驗室的檢測結果一致。該方法準確度高、實用性強，能滿足實際樣品中亮綠、亞甲基藍及其代謝物的檢測要求。