固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析乙烯利在棉籽、棉葉和土壤中的殘留

湯 濤，張昌朋，吳 珉，許振嵐，何紅梅，張春榮，趙學平

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所/省部共建國家重點實驗室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點實驗室”/農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，浙江 杭州 310021)

乙烯利(Ethephon)又名乙烯磷,是一種人工合成的植物生長調(diào)節(jié)激素，可以釋放出乙烯，具有促進果實成熟、調(diào)節(jié)性別轉(zhuǎn)化等作用，常作為脫葉劑應用于棉花作物[1-2]。已有的研究表明乙烯利具有神經(jīng)毒性，對皮膚、眼睛、黏膜有刺激作用，食用過量乙烯利可加速消化道衰老，造成消化道潰瘍，影響大腦和腎臟健康，對動物免疫和生殖系統(tǒng)也有一定的損害[3-4]。棉籽油具有天然的抗氧化能力，是我國棉花主產(chǎn)區(qū)居民的主要食用植物油之一，年產(chǎn)量居我國食用植物油的第四位，同時棉籽經(jīng)脫殼提油后所得的棉籽粕中，蛋白質(zhì)含量可達40%～50%，在質(zhì)量上近似豆類蛋白，是畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)質(zhì)飼料[5-7]。乙烯利的每日允許攝入量(Acceptable daily intake,ADI)為0.05 mg/kg bw，我國規(guī)定其在棉籽中的最大殘留限量(Maximum residue limit,MRL)為2 mg/kg[8]。目前已報道的關于乙烯利的檢測方法主要有離子色譜法[9-12]、氣相色譜法[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-18]。其中，離子色譜法為半定性分析，很難對乙烯利殘留進行準確的定量檢測；氣相色譜法一般需要進行衍生化，或使其在堿性條件下加熱分解出乙烯，再結(jié)合頂空進樣方式進行檢測，該方法的樣品前處理步驟多、操作復雜，且定量的準確性易受衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性或釋放出乙烯的量所限制。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)具有靈敏度高、選擇性好、特異性強和分析速度快的優(yōu)點，Xie等[16]采用LC-MS/MS方法分析了乙烯利、噻苯隆和敵草隆等植物生長調(diào)節(jié)劑在棉花中的殘留量，測得乙烯利在棉花中的檢測定量限(LOQ)為0.04 mg/kg，Su等[17]采用QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS方法檢測了多種果蔬中的乙烯利殘留量，樣品經(jīng)石墨化碳(GCB)和N-丙基乙二胺(PSA)凈化后檢測，測得乙烯利在黃瓜等果樹中的LOQ為1.2～2.2 mg/kg。

本研究以棉籽、棉葉和土壤為供試材料，采用固相萃取法結(jié)合UPLC-MS/MS技術，擬開發(fā)靈敏度更高的乙烯利分析方法，通過對實際樣品的檢測來驗證方法的可靠性，所建方法有望用于棉籽中乙烯利殘留的抽檢監(jiān)測及該藥的殘留登記試驗。

1 實驗部分

1.1 儀器與試材

UPLC-MS/MS-8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；SPS402F電子天平(精確至 0.01 g，奧豪斯公司)；AB135-S 電子天平(精確至0.1 mg，梅特勒-托利多公司)；TYZD-IIA振蕩器(天儀電子儀器有限公司)；VTX-3000L渦旋儀(杭州雷琪試驗器材公司)；12通道固相萃取裝置(美國Supelco公司)；3-18k高速離心機(德國Sigma公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及V-700真空泵(瑞士Buchi公司)。

乙烯利標準品(純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；75%乙烯利水劑(紹興市東湖生化有限公司)；Oasis MAX(3 cc,60 mg)、Oasis HLB(3 cc,60 mg)和Oasis WAX(3 cc,60 mg)固相萃取凈化柱(美國Waters公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸、氨水(色譜純，上海凌峰化學試劑有限公司)；實驗用水均為經(jīng)Milli-Q 超純水器純化的超純水。

1.2 標準溶液的配制

精確稱取乙烯利標準品0.01 g(精確至0.1 mg)，以甲醇溶解并定容至50 mL，配制194 mg/L乙烯利標準儲備溶液。用甲醇稀釋至97 mg/L，再分別用甲醇、棉籽、棉葉和土壤3種不同空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，配制成0.02、0.097、0.194、0.97、1.94 mg/L乙烯利系列濃度標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

提?。簻蚀_稱取各類樣品(棉籽、棉葉、土壤) 5 g于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇-1%甲酸(70∶30，體積比)提取液，渦旋提取2 min，4 000 r/min條件下離心5 min。移出5 mL提取液待凈化。

凈化：Oasis MAX(3 cc,60 mg)固相萃取小柱經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水活化后，將5 mL提取液上樣并用3 mL甲醇淋洗，棄去淋出液，用6 mL含2%甲酸的甲醇洗脫后，洗脫液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)濃縮并氮吹至干，用流動相定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 儀器檢測條件

色譜條件：色譜柱為Waters CORTECS HILIC(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)超高效液相色譜柱，流動相為0.01%氨水溶液-乙腈(80∶20，體積比)，流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為ESI-，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式；Interface volta為4 kV，霧化氣流速為3.0 L/min，干燥氣流速為10.0 L/min，加熱氣流速為10.0 L/min，Interface 溫度為300 ℃，脫溶劑管溫度為250 ℃，Heat Block溫度為400 ℃；碰撞能量為-22 eV和-25 eV(碰撞氣為Ar)，駐停時間為100 ms，母離子m/z143，子離子m/z107(定量)，子離子m/z79(定性)。

1.5 實際樣品的制備

2017 年在浙江和山東 2 地對棉花田施用75%乙烯利水劑，小區(qū)面積30 m2，劑量為1 687.5 g a.i./ha，處理重復3次，另設清水空白對照。施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d采集棉葉和土壤樣品，最后一次同時采集棉籽樣品，采集的樣品切碎、研磨、混勻后貯存于-20 ℃冰柜中待測。

圖1 不同提取溶劑對乙烯利的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of ethephon with different solvents

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

合適的提取溶劑是保證目標組分回收率的關鍵，通常情況下，提取溶劑的選取需要依據(jù)目標組分的物化性質(zhì)及樣品的類型來確定[19]。常用于農(nóng)藥殘留檢測的提取劑主要有乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯等[20]。根據(jù)乙烯利的溶解度特性和樣品的性質(zhì)，在0.194 mg/kg加標水平條件下，乙腈、甲醇和甲醇-1%甲酸(70∶30，體積比)混合提取液對3種基質(zhì)的提取效率見圖1。結(jié)果表明，乙腈對3種基質(zhì)中乙烯利的提取效率最低(17%～26%)，Xie等[16]采用乙腈提取棉花樣品時未檢出乙烯利，說明乙腈不適于作為乙烯利在多數(shù)樣品中的提取溶劑；用甲醇作提取溶劑時，土壤中乙烯利的提取效率為75%，基本滿足要求，但對棉籽和棉葉中乙烯利的提取效率較差(分別為57%和48%)；以甲醇-1%甲酸(70∶30)二元混合提取液作為提取溶劑時，乙烯利在3種基質(zhì)中的提取效率較高(85%～92%)，且共提出的雜質(zhì)較少。因此，本實驗選用甲醇-1%甲酸(70∶30)混合提取液作為3種不同基質(zhì)中乙烯利殘留的提取溶劑。

2.2 SPE小柱的選擇

乙烯利是帶有磷酸根并具有強極性的二元酸(pKa=2.5和7.2)[18]，根據(jù)乙烯利的物化特性，選取并比較了適用于酸堿和中性農(nóng)藥的Oasis HLB、強酸性農(nóng)藥的Oasis WAX和酸性農(nóng)藥的Oasis MAX 3種凈化柱對棉籽、棉葉及土壤基質(zhì)中乙烯利的凈化效果，以含2%甲酸的甲醇作為洗脫劑。結(jié)果表明，在0.194 mg/kg 加標水平下，Oasis MAX小柱對3種基質(zhì)的凈化效果最好，且回收率較高(82%～91%)；Oasis HLB小柱對3種基質(zhì)的凈化效果也較好，但乙烯利的回收率較低(65%～72%)；而Oasis WAX小柱對乙烯利的回收率最低(43%～50%)。這可能與Oasis MAX小柱的填料性質(zhì)有關，其填料為弱陰離子吸附劑(pKa=6.0)。因此本研究選用Oasis MAX作為不同基質(zhì)提取液的凈化小柱。

2.3 流動相的選擇

在棉籽中添加0.194 mg/kg乙烯利水平下，按照優(yōu)化的樣品前處理方法，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01%氨水和乙腈-0.05%氨水作為流動相體系時對乙烯利的分離效果和響應強度。結(jié)果表明，以乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸作為流動相時，乙烯利的峰形差，且響應值很低(圖2A和圖2B)；以乙腈-0.01%氨水作為流動相時，響應值較好，但峰形拖尾，且乙烯利的保留時間漂移(圖2C)；以乙腈-0.05%氨水作為流動相時，乙烯利峰形和響應值均較好，且基線平穩(wěn)，保留時間合適(圖2D)。綜合考慮，最終選擇乙腈-0.05%氨水作為乙烯利檢測分析的流動相。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用1.94 mg/L的乙烯利標準溶液，在連接兩通的條件下，流動相組成為0.01%氨水溶液和乙腈(50∶50，體積比)，流速0.2 mL/min，進樣體積1 μL，分別用電噴霧電離正離子模式( ESI+)和電噴霧電離負離子模式( ESI-)進行母離子全掃描，掃描范圍m/z為100～500。結(jié)果表明：在負離子模式下(ESI-)，乙烯利的電離效果最佳，信號強度高于正離子模式，獲得m/z143的[M-H]-準分子離子峰。對乙烯利的[M-H]-進行二級質(zhì)譜掃描得到碎片離子，選擇m/z143/107 和m/z143/79分別為定量和定性離子對，當碰撞能量為 -22 eV 時，碎片離子m/z107的響應值大于m/z79，因此選擇m/z107作為定量離子。

圖3 乙烯利在溶劑和各基質(zhì)提取液中的標準曲線Fig.3 Standard curves of ethephon in solvent and matrix-matched extracts

2.5 基質(zhì)效應分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測農(nóng)藥殘留時，基質(zhì)效應(Matrix effect，ME)是經(jīng)常遇到的問題，在樣品提取凈化過程中共流出的雜質(zhì)可增強或抑制目標組分的離子化效率，從而導致檢測誤差[21]。一般情況下，采用基質(zhì)標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比值增加或減少的百分比來評價基質(zhì)效應，計算公式為ME=(a-b)/a×100%(a和b分別為基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線的斜率)。當|ME|<20%時表示基質(zhì)效應較小，可采用溶劑標定；當20%≤|ME|≤50%時表示基質(zhì)效應較大，應考慮采用基質(zhì)標定；當|ME|>50%時表示基質(zhì)效應很強，需繼續(xù)優(yōu)化樣品前處理方法以降低基質(zhì)效應[22]。本研究采用溶劑和各基質(zhì)提取凈化液分別配制乙烯利的系列標準工作液，在已確定的儀器條件下進樣，并繪制標準曲線評價基質(zhì)效應。結(jié)果表明，乙烯利在0.02～1.94 mg/L范圍內(nèi)，在溶劑及各基質(zhì)提取液中的線性關系良好(圖3)，r2≥0.996 3，計算得到乙烯利在棉籽、棉葉和土壤中的基質(zhì)效應系數(shù)分別為13.4%、7.2%和-17.4%，各基質(zhì)效應系數(shù)的絕對值均小于20%，因此本研究采用溶劑標匹配外標法對乙烯利進行準確定量。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

在優(yōu)化條件下，考察乙烯利的線性關系，結(jié)果顯示，乙烯利的峰面積與其質(zhì)量濃度在0.02～1.94 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，其標準曲線方程為：y=2.79×106x+2.11×104(r2=0.998 3)。以最低添加水平的信噪比S/N≥3作為方法的檢出限(LOD)，S/N≥10作為方法的定量下限(LOQ)，測得乙烯利在棉籽、棉葉和土壤3種基質(zhì)中的LOD和LOQ分別為0.01 mg/kg和0.02 mg/kg。

表1 乙烯利在棉籽、棉葉和土壤空白樣品中的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Table 1 Recoveries and RSDs of ethephon in cotton seed,cotton leaf and soil(n=5)

2.7 回收率與相對標準偏差

在優(yōu)化條件下，采用棉籽、棉葉和土壤空白樣品進行加標回收實驗，每種基質(zhì)分別加標0.02、0.194和3.88 mg/kg 3個水平，每個加標水平重復5次。結(jié)果表明：乙烯利在3種基質(zhì)中的回收率為78.3%～95.1%，RSD為1.9%～5.2%，回收率和相對標準偏差均符合NY/T788-2004《農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求[23]。

2.8 方法應用

采用本文建立的方法對浙江省和山東省2個試驗點施用乙烯利的棉田樣品進行檢測(表2)。結(jié)果表明：在2地的棉籽樣品中均未檢出乙烯利；浙江點的棉葉中乙烯利的檢出范圍為0.22～31 mg/kg，消解規(guī)律符合一級動力學方程，Ct=22.028 3e-0.170 1t，降解半衰期為4.1 d；山東點的棉葉中乙烯利的檢出范圍為0.23～22 mg/kg，消解規(guī)律符合一級動力學方程，Ct=19.577 6e-0.228 0t，降解半衰期為3.0 d；浙江點的土壤中乙烯利檢出范圍為0.17～8.9 mg/kg，消解動力學方程為Ct=8.270 6e-0.125 2t，消解半衰期為5.5 d；山東點的土壤中乙烯利檢出范圍為0.19～4.0 mg/kg，消解動力學方程為Ct=3.484 1e-0.134 2t，消解半衰期為5.2 d。從檢測結(jié)果看，乙烯利在棉葉和土壤中的消解速率較快，施藥后28 d時其殘留量已很低。

表2 乙烯利在棉葉和土壤中的殘留量Table 2 Content of ethephon residues in cotton leaf and soil w/(mg·kg-1)

3 結(jié) 論

本研究采用固相萃取(Oasis MAX凈化柱)樣品前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術，以及負離子和多反應監(jiān)測模式，建立了棉籽、棉葉和土壤中乙烯利殘留的檢測方法。在優(yōu)化條件下，乙烯利在棉籽、棉葉和土壤中的回收率為 78.3%～95.1%，RSD為 1.9%～5.2%，3種基質(zhì)中的LOQ均為 0.02 mg/kg，方法的靈敏度符合農(nóng)藥殘留檢測要求。通過對實際樣品的檢測，表明所建方法具有操作簡單、提取試劑毒性較低、重復性好、靈敏度高等特點，適用于棉籽中乙烯利殘留的抽檢監(jiān)測及該藥的殘留登記試驗。