超高效液相色譜法同時測定牙膏中5種植物源活性成分

2019-01-22 11:15:18譚建華李慧勇郭長虹熊小婷夏澤敏李少飛莫庭源廖惠媚

分析測試學報 2019年1期

楊培，譚建華，李慧勇，郭長虹，熊小婷，夏澤敏，李少飛，莫庭源，廖惠媚

(廣州質量監督檢測研究院，廣東廣州 510000)

天然植物中存在豐富的生物活性物質，早在1985年，已有1 600多種植物被報道具有抗真菌、抗細菌等防止有害生物的活性[1]。隨后，國內外的大量研究證明多種植物提取物含有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化等多種生物活性成分[2-4]。隨著植物源活性成分研究的深入，以及“天然”理念在產品設計中的推崇，越來越多的植物源活性成分被應用于牙膏的配方中，如牡丹皮提取物的丹皮酚(Pae)[5]，厚樸提取物中的厚樸酚(Mag)、和厚樸酚(Hon)[6]，甘草的主要成分甘草次酸(Gly)[7]，百里香屬植物揮發油的主要成分麝香草酚(Thy)[8]等。此類化合物均為藥物成分，具有一定的藥性[9]：甘草味甘、性平，但甘草中甘草次酸的結構和作用類似于腎上腺皮質激素，長期濫用會產生身體浮腫、血鈉濃度升高等不良反應[10-11]；厚樸、和厚樸酚類雖具有較大的臨床功效，但報道顯示中藥減肥人群中腎功能衰竭與防己、厚樸有關[12]；麝香草酚對HEK293 細胞和Vero細胞的最大無毒濃度分別為62.5 mg/L和50 mg/L[13]。因此，牙膏中過量添加此類藥用成分可能有潛在危害。為監控產品質量，保障消費者的健康，亟需建立牙膏中該5種化合物的檢測方法。

目前，僅QB/T 2966-2014《功效性牙膏》[14]中規定了丹皮酚的測試方法，牙膏中麝香草酚等其他4種物質尚無標準，該4種物質的相關研究主要集中于膠囊、軟膏、藥丸、藥材、口服液等藥物領域，分析方法包括氣相色譜法(GC)[15-18]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[19-21]、超臨界流體色譜法(SFC)[22]、液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)[23]、毛細管電泳法(CE)[24]、電化學法[25]、近紅外光譜法(NIR)[26-27]及液相色譜法[28-31]。本研究采用超高效液相色譜建立了牙膏中丹皮酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚、甘草次酸5種植物源活性成分的快速測定方法，方法簡便、快速、靈敏、準確，可滿足牙膏中5種植物源活性成分的檢測要求，已成功應用于實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀配PDA二極管陣列檢測器(美國Waters公司)，Milli-Q 超純水器(美國Millipore公司)，Allegra 64R centrifuge臺式高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)，超聲儀(上海Kudos公司)，電子分析天平(精確至0.01 mg和0.1 mg)。標準品：丹皮酚、厚樸酚、和厚樸酚、甘草次酸(純度98%，上海Nature Standard公司)，麝香草酚(純度99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)。甲酸(純度98%,上海阿拉丁試劑有限公司)，乙腈、甲醇(色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司)，其他試劑為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的制備

分別稱取丹皮酚、麝香草酚、厚樸酚、和厚樸酚、甘草次酸標準品各0.1 g(精確至0.000 1g)于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質量濃度為2 000 mg/L 的混合標準儲備溶液。準確移取適量標準儲備溶液于容量瓶中，用90%(體積分數)甲醇逐級稀釋成質量濃度為1、5、10、25、50、75、100 mg/L的混合標準工作溶液，待測。

1.3 樣品的提取

稱取牙膏樣品1 g(精確至0.001 g)于10 mL具塞比色管中，以90%甲醇定容，加入適量石英砂，于渦旋振蕩器上振蕩混勻，超聲提取15 min，靜置至室溫，經0.22 μm濾膜過濾后，濾液待測。必要時以90%甲醇稀釋濾液，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?HSS C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，流速：0.3 mL/min，進樣量：3 μL，柱溫：30 ℃。流動相：0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～1.5 min，70%～60% A；1.5～5.5 min，60%～0% A；5.5～6.0 min，0% A；6.0～6.5 min，0%～70% A；6.5～9.0 min，70% A。檢測波長：丹皮酚、麝香草酚為275 nm；和厚樸酚、厚樸酚、甘草次酸為250 nm。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

圖1 甲醇體積分數對樣品加標響應面積的影響Fig.1 Effect of volume fraction of methanol on response area of the sample

2.2 提取溶劑的優化

待測化合物的化學性質各異，且待測化合物作為牙膏的添加成分，與牙膏中其他基礎成分(摩擦劑、發泡劑、保濕劑、增稠劑等)間的化學性質不同，因此待測化合物間、待測化合物與牙膏其他基礎成分間于不同溶劑中的溶解度均有差異。本文分別考察了不同有機溶劑以及有機溶劑體積分數對加標樣品提取效果的影響。

實驗考察了不同有機溶劑(甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、四氫呋喃)對加標樣品提取效果的影響，結果表明，以甲醇為溶劑時的提取效率較高，且雜質干擾較小。另考察了甲醇的體積分數對提取效果的影響,由圖1可知，當甲醇的體積分數由10%增至90%時，5種化合物的響應值逐漸增大；繼續增大甲醇的體積分數，5種化合物的響應值基本不變。由于牙膏的發泡劑成分(如十二烷基硫酸鈉、十二酰基肌氨酸鈉)、增稠劑成分(如羧甲基纖維素鈉、黃原膠)的水溶性較好，為保證牙膏樣品在提取溶劑中的分散效果，本文選擇90%甲醇為提取溶劑。

2.3 流動相的選擇

考察了流動相pH值(2.0、2.8、4.0、5.0、6.0、7.0)對分離效果的影響，結果表明，當pH≥6.0時，甘草次酸的色譜峰變寬，出峰時間逐漸提前。色譜峰變寬可能是由于pH≥6.0時甘草次酸離子化后與固定相殘留的硅醇基相互作用增強；出峰時間提前是由于甘草次酸離子化后極性增強，在反相色譜柱中的保留變弱。因此應選擇流動相pH<6.0，以避免甘草次酸離子化。由于pH 2.8時丹皮酚、麝香草酚、厚樸酚、和厚樸酚的半峰寬較小，分離度較高，且甘草次酸的峰對稱性及分離度滿足實驗要求，因此采用0.1% 甲酸(pH 2.8)為流動相。

2.4 線性關系、檢出限及定量下限

取“1.2”中配制的標準溶液，采用本方法進行測定，其標準溶液的色譜圖見圖2。以Pae、Thy、Hon、Mag和Gly的質量濃度(X，mg/L)為橫坐標，對應的峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸。由表1可知，Pae、Thy、Hon和Mag在2～100 mg/L 范圍內，Gly在5～100 mg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r)均大于0.999。采用基質樣品加標方法，通過計算其樣品加標的響應與背景噪音的比值分別確定方法檢出限(S/N≈3)和定量下限(S/N≈10)，得到5種化合物的方法檢出限(LOD)為0.2～1.0 mg/kg，定量下限(LOQ)為0.8～3.5 mg/kg(表1)。

CompoundLinear equationLinear range(mg/L)rLOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)PaeY=192 558X+93 8392～1000.999 10.20.8ThyY=830X+16 5432～1000.999 60.51.7HonY=70 734X+47 0292～1000.999 00.51.7MagY=25 366X+31 6202～1000.999 80.51.7GlyY=13 612X+24 7715～1000.999 51.03.5

2.5 回收率與相對標準偏差

為驗證該方法對不同基質牙膏的適用性，選取3種不同配方體系的空白牙膏樣品——水合硅石(SiO2)、磷酸氫鈣(CaHPO3)和碳酸鈣(CaCO3)體系，分別加入4個濃度的Pae、Thy、Hon、Mag和Gly混合標準溶液進行加標回收實驗。由表2可知，5種化合物在4個加標水平的平均回收率為90.5%～99.4%，相對標準偏差(RSD)為0.7%～5.1%，表明方法具有較高的準確度，且精密度良好。