石墨烯修飾電極電化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定甲巰咪唑

熊海濤,吳迎春，唐志華，龐海霞

(1.陜西理工大學(xué) 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 陜西 漢中 723001)

甲巰咪唑(Methimazole),又稱他巴唑，臨床上常用于治療甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥，主要通過(guò)抑制甲狀腺內(nèi)過(guò)氧化物酶活性[1]阻礙吸聚到甲狀腺內(nèi)碘化物的氧化及酪氨酸的偶聯(lián)，進(jìn)而阻止甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)的合成而達(dá)到治療作用。過(guò)量服用可引起腎炎、皮膚過(guò)敏、消化道不適、咽炎發(fā)燒及肝膽損傷等毒副作用[2]。因此，建立一種快速、靈敏且準(zhǔn)確測(cè)定甲巰咪唑含量的分析方法具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外常用于甲巰咪唑檢測(cè)分析的方法有紫外-可見(jiàn)分光光度法[3-5]、高效液相色譜法[6-8]、熒光光度法[9-10]、電化學(xué)分析法[1,11-13]及流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[14-15]等，但這些方法大多存在靈敏度較低、儀器昂貴、受散射光影響或試劑消耗量大等不足。此外，也有少量利用電化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定甲巰咪唑的文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，然而文獻(xiàn)[16]使用的電化學(xué)發(fā)光探針制備十分繁瑣，而文獻(xiàn)[17]采用流動(dòng)注射進(jìn)樣技術(shù)易造成試劑浪費(fèi)。

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence,ECL)，又稱電致化學(xué)發(fā)光，是通過(guò)電解使電極表面新產(chǎn)生的組分之間或該新組分與電解液中某種組分相互反應(yīng)后而產(chǎn)生的一種光輻射現(xiàn)象[18-19]。通過(guò)檢測(cè)體系發(fā)光信號(hào)來(lái)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析的技術(shù)稱為電化學(xué)發(fā)光分析法，已被廣泛應(yīng)用于臨床藥物的檢測(cè)分析[20-21]。近年來(lái)，碳族納米材料因具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、較大的比表面積、快速的電子傳遞特性及良好的生物相容性等[22-23]而倍受分析化學(xué)家的青睞。與碳量子點(diǎn)相比，碳納米管與石墨烯均具有良好的電催化性能。但石墨烯可在普通實(shí)驗(yàn)室輕易制備成功，無(wú)需復(fù)雜的酸化處理過(guò)程，且毒性較低。因此，石墨烯已被作為一種理想的碳族材料來(lái)構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感界面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子[24-25]及生物大分子[26-27]的高靈敏檢測(cè)。

本文基于甲巰咪唑能強(qiáng)烈增敏魯米諾在石墨烯修飾玻碳電極(堿性介質(zhì)中)表面的電化學(xué)發(fā)光建立了一種直接測(cè)定甲巰咪唑含量的電化學(xué)發(fā)光新方法。該方法分析速度快且具有較高的靈敏度，有望應(yīng)用于甲巰咪唑的臨床檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀、IFFS-A型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(西安瑞邁分析儀器有限公司)；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；CHI600D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：以石墨烯修飾電極(Graphene/GCE)為工作電極，Pt絲電極為輔助電極，Ag/AgCl電極為參比電極(飽和KCl溶液)。

甲巰咪唑(MTZ,純度>99%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲巰咪唑片(含量>98%，北京市燕京藥業(yè)有限公司)；無(wú)水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；硼砂、氯化鉀(西安聚信化工有限公司)；鐵氰化鉀(鄭州瑞爾化工產(chǎn)品有限公司)；亞鐵氰化鉀(上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1.0 mg·mL-1石墨烯(用DMF溶解)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，所用試劑均為分析純。

0.01 mol·L-1甲巰咪唑儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.114 2 g的甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，用少量(約20 mL)無(wú)水乙醇溶解，再用高純水洗滌燒杯及玻璃棒并定容至100 mL容量瓶中，搖勻備用；10 mmol·L-1魯米諾(Luminol)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.177 2 g 魯米諾，然后用0.01 mol·L-1NaOH溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，避光備用。

電化學(xué)分析探針：0.1 mmol·L-1KCl+5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]+5.0 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O。

1.2 石墨烯修飾電極(Graphene/GCE)的制備

將裸玻碳電極在麂皮上用拋光粉(Al2O3)打磨成鏡面，然后用水洗凈。依次用無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗5 min，晾干備用。取8.0 μL經(jīng)充分超聲分散的石墨烯(1.0 mg·mL-1)滴涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面，室溫下晾置3 h，待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取3.0 mL含有2.0×10-6mol·L-1魯米諾的NaOH(0.01 mol·L-1)作電解液，采用三電極系統(tǒng)，在0.15～0.95 V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描，同時(shí)記錄CV曲線與電化學(xué)發(fā)光信號(hào)(I0)。隨后，在上述溶液中加入少量標(biāo)準(zhǔn)系列甲巰咪唑溶液，同時(shí)進(jìn)行掃描并記錄相應(yīng)的CV曲線及電化學(xué)發(fā)光信號(hào)(It)，以相對(duì)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)(ΔI=It-I0)進(jìn)行樣品的定量分析。

圖1 裸GCE(a)和Graphene/GCE(b)的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms at the bare GCE(a) and graphene modified GCE(b)electrolyte:5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]+0.1 mmol·L-1 KCl;scaning rate:100 mV/s

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯修飾電極的表征

以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]為電化學(xué)探針，依次將裸玻碳電極和石墨烯修飾電極在-0.2～0.6 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，考察了石墨烯修飾電極的電化學(xué)特性。結(jié)果表明：在裸GCE上，其氧化峰電流為281 μA，而在Graphene/GCE上，氧化峰的峰電流增高至587 μA(圖1)。這說(shuō)明修飾在GCE表面的石墨烯增大了其比表面積并有效地提高了電極的電子傳遞能力。

2.2 魯米諾在裸GCE及Graphene/GCE上的電化學(xué)行為及電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)

在0.15～0.95 V電位范圍內(nèi)，分別記錄了加入少量MTZ前后裸GCE及Graphene/GCE在堿性魯米諾溶液中的電化學(xué)行為及電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)。結(jié)果表明：溶液中未加入MTZ時(shí)，裸GCE(圖2A曲線a)與Graphene/GCE(圖2A曲線c)均呈現(xiàn)較弱的伏安響應(yīng)，其在0.72 V左右相應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)分別為168(圖2B曲線a)、347(圖2B曲線c)；而當(dāng)加入一定量MTZ后，裸GCE(圖2A曲線b)與Graphene/GCE(圖2A曲線d)在0.72 V電位處的氧化電流均明顯增大，其相應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)分別升至442(圖2B曲線b)和1 205(圖2B曲線d),此時(shí)，裸GCE與Graphene/GCE的電化學(xué)發(fā)光信噪比分別為2.63、3.47。由此可見(jiàn)，MTZ在Graphene/GCE表面更易被氧化并增敏魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。這可能是由于MTZ分子中的巰基在0.72 V附近被氧化并增敏了魯米諾的氧化電流，伴隨著更強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的產(chǎn)生。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1反應(yīng)介質(zhì)的選擇由于魯米諾在堿性介質(zhì)中往往能呈現(xiàn)出較好的電化學(xué)發(fā)光特性，實(shí)驗(yàn)分別考察了在飽和硼砂、0.1 mol·L-1Na2CO3、0.1 mol·L-1NaHCO3、0.1 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3及0.01 mol·L-1NaOH 5種不同反應(yīng)介質(zhì)中體系的電化學(xué)發(fā)光(信噪比S/N)。結(jié)果顯示：在0.01 mol·L-1NaOH介質(zhì)中體系呈現(xiàn)最大的信噪比，故本實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)介質(zhì)為0.01 mol·L-1NaOH。

2.3.2石墨烯用量的選擇分別將4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0 μL的石墨烯糊狀溶液(1.0 mg·mL-1)滴涂于6支不同的玻碳電極表面制成石墨烯修飾電極，再將其作為工作電極依次進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)。研究表明：隨著石墨烯用量的增加，電化學(xué)發(fā)光信噪比逐漸增大，但石墨烯用量達(dá)8.0 μL后，體系信噪比不再增加且略有下降。這可能是由于石墨烯用量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致其在玻碳電極表面的厚度增加，反而阻礙了電子的有效傳遞。因此，石墨烯的最佳用量選擇8.0 μL。

2.3.3魯米諾濃度的選擇本研究中，魯米諾作為電化學(xué)發(fā)光試劑，其濃度是影響方法靈敏度的重要因素之一。實(shí)驗(yàn)考察了魯米諾濃度為0.1～1.1 μmol·L-1時(shí)對(duì)電化學(xué)發(fā)光信噪比的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：電化學(xué)發(fā)光信噪比隨著魯米諾濃度的增加逐漸增大，在魯米諾濃度為0.7 μmol·L-1時(shí)達(dá)最大值，此后呈下降趨勢(shì)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇魯米諾濃度為0.7 μmol·L-1。

2.3.4掃描速率對(duì)ECL增敏的影響本實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法掃描，考察了掃描速率(20～200 mV/s)對(duì)ECL分析信號(hào)的影響。結(jié)果表明：甲巰咪唑?qū)A性魯米諾在石墨烯修飾電極上的ECL增敏程度隨掃描速率的增大而增大，當(dāng)掃描速率為100 mV/s時(shí)，甲巰咪唑的增敏作用最大；此后再增大掃描速率，ECL增敏程度基本保持不變。故實(shí)驗(yàn)選擇最佳掃描速率為100 mV/s。

2.4 線性范圍、檢出限及精密度

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，甲巰咪唑在6.0×10-8～1.0×10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)與其增敏的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(ΔIECL)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，線性方程為ΔIECL=1 646.23c-42.22(r=0.996 7)。按照IUPAC估算出方法的檢出限(LOD)為2.0×10-8mol·L-1。另外，應(yīng)用Graphene/GCE對(duì)0.5 μmol·L-1甲巰咪唑進(jìn)行連續(xù)11次電化學(xué)掃描并記錄電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.5%，表明該分析法具有較高的精密度。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

2.6 實(shí)際樣品分析

取甲巰咪唑片10片，準(zhǔn)確稱取適量并研細(xì)，加水溶解,過(guò)濾并定容至100 mL，精密移取1.0 mL進(jìn)行二次稀釋,定容至100 mL容量瓶中。取不同體積的上述稀釋溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法在優(yōu)化條件下測(cè)定，同時(shí)加入不同濃度的甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得平均回收率為90.0%～107%，RSD為2.5%～3.4%(表2)，結(jié)果令人滿意。

表2 甲巰咪唑的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 2 Average recoveries and RSDs of MTZ(n=3)

3 結(jié) 論

本研究利用堿性介質(zhì)中少量甲巰咪唑能顯著增敏魯米諾在Graphene/GCE表面電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的原理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲巰咪唑的高靈敏檢測(cè)。該方法通過(guò)在玻碳電極表面修飾石墨烯提高了其分析特征，對(duì)了解甲巰咪唑在生物體內(nèi)的代謝水平和作用機(jī)制具有重要的參考意義。