掃描電化學顯微鏡用于研究生物膜微環境的電子傳遞

田曉春 ，吳雪娥 ，詹東平 ，趙峰 ，姜艷霞 ，孫世剛

1廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005

2中國科學院城市環境研究所，中國科學院城市污染物轉化重點實驗室，福建 廈門 361021

1 引言

生物電化學系統利用微生物催化不同氧化還原反應實現電子轉移，已應用于污染物強化轉化和微生物產電等領域1，是一種發展前景廣闊的能源物質轉化新技術。目前，電化學活性微生物的胞外電子傳遞途徑主要包括直接電子傳遞和間接電子傳遞2，其中，電子穿梭體介導的間接電子傳遞可提高生物電化學系統的能量轉化率3,4，其相關研究能推動污染修復及生物能源的發展5。

伏安法、恒電位法是研究微生物在電極/溶液界面轉移電子的重要手段6–8。Marsili等9利用循環伏安和恒電位，測得Shewanella生物膜分泌的flavins能介導電子傳遞并在微生物細胞和胞外固體間進行周期性氧化還原循環。但是，這種間接電子傳遞途徑是基于生物膜層面的推測，由于生物膜內部組成復雜，其中包含的各種分泌物10、胞外聚合物等也具有電子傳遞以及氧化還原能力11,12，因此這種機制有待于進一步確認。

掃描電化學顯微鏡(SECM)13,14的微電極具有準確定位、靈敏度高的特點，已用于監測生物膜的形成及其微區環境的變化，如pH15,16、銅離子濃度分布17、H2O2濃度18,19等。SECM的微電極在三維空間的位置能夠準確控制，當微電極沒有直接接觸到微生物細胞且二者距離超過10 nm，微電極不會收集到由直接電子傳遞途徑所產生的電流。如果有電子中介體在微生物和探針電極之間介導電子轉移，那么探針電極收集的電流僅來自間接電子傳遞的貢獻；此外，利用SECM的穿透模式能夠得到微電極穿過生物膜過程中的電流變化，從而反映微生物在電極/溶液界面的分布。因此，本論文構建SECM體系，利用穿透模式研究微生物在電極/溶液界面的電子傳遞方式和空間分布。另外，在構建SECM體系時，需要選擇合適的電子穿梭體，考慮到自然界中廣泛存在微生物與含鐵礦物的相互作用以及地球化學鐵循環的意義，選擇電化學性質簡單、明確的可溶性鐵化合物二茂鐵甲醇(FcMeOH)作為電子穿梭體介導Shewanella的間接電子傳遞過程。本研究基于SECM 的穿透模式，通過微電極收集來自間接電子傳遞產生的電流，測定電極/溶液界面生物膜的厚度等空間分布信息。

2 實驗部分

2.1 試劑和材料

試劑：二茂鐵甲醇(FcMeOH，購買于Sigma-Aldrich)；蛋白胨和酵母提取物由英國Oxoid公司生產，為生物技術級。NaCl、KCl、NaH2PO4和Na2HPO4均為分析純。

材料：氧化銦錫導電玻璃(ITO，厚1.1 mm，表面電阻＜ 17 Ω·□-1)購買于珠海凱為光電科技有限公司；鉑絲(直徑25 μm)購買于阿法埃莎(天津)化學有限公司；飽和甘汞電極和Ag/AgCl參比電極購買于上海辰華儀器有限公司。

2.2 微生物的培養

實驗中使用的菌株 Shewanella oneidensis MR-1在pH為7.0的Luria-Bertani (LB)培養基中32 °C恒溫培養18 h。其中，LB培養基的組成為蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1和氯化鈉5 g·L-1。

本實驗中將微生物富集在 ITO電極表面的步驟如下：首先，以5000 r·min-1的轉速離心菌液，除去發酵上清液；用100 mmol·L-1的PBS (pH 7.0)溶液重新分散后離心清洗；重復兩次后，用移液槍移取沉淀覆蓋在電極表面，自然風干至微生物附著在電極表面不會脫落。

2.3 電化學實驗

實驗中使用上海辰華儀器有限公司生產的CHI660D電化學工作站研究微生物的電化學性質。掃描電化學顯微鏡使用CHI920C電化學工作站，構建三電極體系時，飽和甘汞電極(SCE)或飽和Ag/AgCl作參比電極，鉑絲作對電極，工作電極為ITO或富集有S. oneidensis MR-1的ITO，探針電極使用自制的直徑為25 μm的Pt微電極，制備方法及表征如圖 S1–S3 (Supporting Information)。

微生物的基本電化學性質測定用磷酸鹽緩沖溶液(PBS：100 mmol·L-1，pH 7.0)作為電解液；在研究微生物與電子穿梭體相互作用的電極過程以及穿透模式時，電解液中含 1 mmol·L-1FcMeOH。

圖1 SECM的穿透模式測定S. oneidensis MR-1生物膜的示意圖(a)和照片(b)Fig. 1 (a) Schematic diagram for penetration mode and (b) image of SECM cell.

圖2 Pt微電極和Shewanella/ITO基底電極的循環伏安圖，掃描速率為50 mV·s–1Fig. 2 CVs of Pt microelectrode and S. oneidensis MR-1/ITO substrate, respectively.Scan rates are 10 mV·s-1.

3 結果與討論

3.1 構建SECM體系測定電極/溶液界面的微生物

穿透模式是SECM的模式之一，利用探針電極穿透微結構獲取電化學信息20。構建SECM體系利用微電極穿透電極/溶液界面的生物膜并獲取電化學信息，原理如圖1a所示。首先，確定可用于SECM實驗體系的基底。排除生物膜組成復雜的影響，將培養好的S. oneidensis MR-1離心清洗后滴加至 ITO 電極表面形成 S. oneidensis MR-1/ITO基底，5 min后向電解池中加入電解液，此時 S. oneidensis MR-1不會立刻擴散至電解液中，因此能保持清晰的溶液/微生物界面，如圖1b所示。其次，以25 μm的Pt微電極作為探針電極。

利用穿透模式測定電極/溶液界面的微生物時，首先要討論電子穿梭體分別在探針電極和基底電極的氧化還原過程。微電極置于含有 1 mmol·L-1FcMeOH 的電解液中，同時記錄微電極和基底電極的循環伏安曲線，結果如圖2所示。其中，曲線 1為 Pt微電極在本體溶液中測得的循環伏安曲線，在-0.2 – +0.6 V范圍內呈“S”形，檢測到的FcMeOH的氧化電流在0.26 V達到穩態為3.2 nA，此值與微電極在1 mmol·L-1FcMeOH溶液中得到的穩態氧化電流值一致(圖 S2)，這說明微生物的存在對本體溶液的FcMeOH的濃度無影響。曲線2為S. oneidensis MR-1/ITO基底電極的氧化還原過程，其中氧化和還原峰 I分別為 S.oneidensis MR-1的氧化和還原(圖S4)，這是其表面與直接電子傳遞相關的細胞色素 c的氧化和還原21,22；在電位高于0.25 V時，氧化電流逐漸增加，此電流來自于FcMeOH的氧化。

另外，圖2中微電極和Shewanella/ITO基底電極經過連續兩周循環伏安掃描，得到的循環伏安曲線幾乎重合，這說明 ITO與 S. oneidensis MR-1形成的界面穩定，該實驗體系適用于Shewanella的電化學性質測定。

3.2 S. oneidensis MR-1與電子中介體相互作用的電極過程

為了進一步確定 FcMeOH與 S. oneidensis MR-1互相作用的界面過程，降低電解液中的FcMeOH濃度至0.01 mmol·L-1，結果如圖3a。其中，曲線2為測定FcMeOH在ITO表面的氧化還原峰(II)電位分別為0.24和0.15 V；當S. oneidensis MR-1在電極/溶液界面時，只能觀察到 FcMeOH的氧化過程(III)，而沒有隨后 FcMeOH+被還原的過程，并且氧化電流達到最大值的電位約為 0.4 V，由此可以推測氧化過程產生的 FcMeOH+被電極表面的微生物還原。電極反應如圖3b所示：開路時，FcMeOH在本體溶液和電極界面以還原態存在，不存在被電極和微生物還原的反應；當電極電勢控制為氧化過程時，電極氧化FcMeOH為FcMeOH+，此時S. oneidensis MR-1能夠將產生的FcMeOH+還原為 FcMeOH，這個過程促進FcMeOH在微生物和電極之間的氧化還原；當電極電勢控制為還原過程時，電極和微生物同時競爭還原在氧化過程產生的 FcMeOH+，FcMeOH+還未及時擴散到電極表面已經被微生物還原，因此電極未檢測到 FcMeOH+的還原峰。因此，FcMeOH能夠作為外源性電子穿梭體介導Shewanella與電極之間的電子傳遞。

圖3 (a) ITO和S. oneidensis MR-1/ITO在0.01 mmol·L-1 FcMeOH溶液中的循環伏安曲線，掃描速率50 mV·s-1；(b) S. oneidensis MR-1與FcMeOH在電極/溶液界面的相互作用Fig. 3 (a) CV curves of ITO and S. oneidensis MR-1 in PBS with 0.01 mmol·L-1 FcMeOH. Scan rate was 50 mV·s-1； (b) Reaction between S. oneidensis MR-1 and FcMeOH at ITO/solution interface during the oxidation and reduction process.

另外，圖3a中的循環伏安曲線1的氧化峰(I)和還原峰(I)均更明顯，這對氧化還原峰與圖 2中曲線 2的氧化還原峰(I)是一致的。此結果也表明FcMeOH未破壞微生物表面的細胞色素 c的電化學活性，是本研究所需要的電子穿梭體。

3.3 穿透模式研究電極/溶液界面Shewanella生物膜的空間結構

圖4 Pt微電極從本體溶液到生物膜的漸進曲線(a)及其示意圖(b)，探針電勢為0.3 V；(c)探針電極穿透生物膜不同距離時的循環伏安曲線，掃描速率為50 mV·s-1Fig. 4 (a) Approaching curve and (b) schematic diagram of Pt tip from bulk solution into biofilm. Probe E = 0.3 V；(c) Cyclic voltammograms of Pt microelectrode which penetrated different distance into biofilm.Scan rates are 50 mV·s-1.

以循環伏安實驗結果為基礎，在穿透模式下，控制微電極從本體溶液起逐漸靠近基底，穿透溶液/微生物/電極的界面，并收集變化的探針電極電流，結果如圖4a，b所示。其中，圖4a中橫坐標d為探針電極從本體溶液向生物膜漸進過程中行進的距離。首先設置探針處于本體溶液，當它在本體溶液中沿 z軸方向漸進時，收集到的電流平穩，來自于本體溶液中的FcMeOH的氧化反應；在探針電極移1100 μm時，電流開始增加，此時微電極進入微生物/溶液界面，根據圖3b中的氧化過程，可以推斷此時電流的增加來源于微生物與電極之間的正反饋；當探針移動約2100 μm時，探針電流達到最大值并且穩定，表明生物膜/溶液界面內的此區域里 FcMeOH的濃度相對均勻區域，厚度約為500 μm；在2600 μm后電流開始呈線性減小，此時探針電極已進入生物膜內部，受微生物的阻礙能擴散到探針電極表面的 FcMeOH減少，同時，微生物能夠將此時產生的FcMeOH+完全還原，因此探針電極電流持續減小。當探針漸進約3700 μm時電極微電極觸碰ITO基底，因此得到實驗中生物膜的厚度約為1100 μm。

為了確認生物膜內探針電極收集到的電流減小的原因，控制探針電極首先在生物膜/溶液的界面處(圖4a中1位置)測量循環伏安曲線，隨后依次漸進 200 μm在生物膜內測試循環伏安曲線(圖4a中2–5位置)，結果如圖 4c中曲線1–5所示。當探針電極進入生物膜之前，得到的循環伏安曲線1已經不同于其在本體溶液中得到的“S”形，但此時氧化過程產生的FcMeOH+在還原過程中仍能被探針電極檢測到，約為-1.2 nA。當微電極進入生物膜之后(循環伏安曲線2–5)，隨著深度增加，氧化電流的起始電位正移；相同氧化電位下的氧化電流逐漸減小，氧化電流在0.5 V之前均未達到穩態。另外，探針電極位于生物膜內時，還原電位對應的電流明顯消失。這些實驗現象反映的結果能夠進一步確定如圖 3b所示的 FcMeOH與Shewanella相互作用的電極反應機理。

4 結論

本文研究了S. oneidensis MR-1與電子穿梭體FcMeOH相互作用的電極反應過程，實現了溶液/微生物/電極界面結構的測定，得到了電子中介體在微生物/溶液進行氧化還原反應區域的厚度約為500 μm，生物膜的厚度為1100 μm；根據FcMeOH在微電極與微生物之間的正反饋作用，利用微電極收集到僅來自于微生物間接電子傳遞過程的電流。基于該研究體系，未來可開展其他電子穿梭體與不同微生物之間介導的電子傳遞機制研究；也可通過基底表面微生物的有序排列以及探針電極納米化，實現單層生物膜甚至微生物個體的空間檢測。該工作從物理化學基礎層面增進了對溶液/微生物/電極界面的胞外電子傳遞機制的理解，也為利用電子穿梭體提高微生物電化學系統的效率奠定了基礎。

Supporting Information:available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.