馬鈴薯軟腐病菌室內藥劑及拮抗細菌篩選

馮迪南，王夢瑤，余成鵬，劉瓊光，2

（1. 華南農業大學農學院，廣東 廣州 510642；2. 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642）

馬鈴薯是我國第四大糧食作物，中國是世界上馬鈴薯第一生產大國。然而，馬鈴薯病害是影響馬鈴薯生產的一大障礙，其中馬鈴薯細菌性軟腐病是大田生產和貯藏期發生最普遍且嚴重的病害之一［1］。引起馬鈴薯腐爛癥狀的病原菌種類主要包括果膠桿菌屬（Pectobacterium）和迪克氏菌屬（Dickeya）中的一些種［2］，其中Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense （簡稱Pcb）分布廣泛，危害嚴重［3］。馬鈴薯作為廣東省冬種作物，種植面積大。近年來，田間馬鈴薯細菌性軟腐病逐年加重，病原細菌可侵染馬鈴薯的塊莖、莖和葉，導致發病部位變黑、組織軟腐、散發惡臭味，嚴重影響馬鈴薯產量和品質。目前，馬鈴薯軟腐病防治的主要措施是以加強栽培管理為主的農業防治，且防治藥劑種類較少［4］，生產上用于防治植物細菌病害的化學藥劑是否對病原細菌Pcb都有效果，尚不十分清楚，因此，有必要篩選對Pcb有明顯抑菌作用的理想藥劑。此外，生物防治因其對環境友好、對人畜安全等諸多優點受到國際廣泛重視，其中的生防細菌是防治植物病害的環保新選擇，并且拮抗菌劑在生產實踐中也取得了令人矚目的成就，顯示出巨大經濟效益和廣闊應用前景［5］，為此，分離篩選有效的拮抗細菌顯得尤為重要。但是，迄今有關馬鈴薯軟腐細菌的拮抗菌篩選以及軟腐病的生物防治研究較少。

本研究以馬鈴薯軟腐病菌Pcb菌株Po-2為指示菌，通過室內平板抑菌試驗，篩選對Pcb抑菌作用較好的化學藥劑，并探索不同藥劑混配的作用效果，進一步篩選和鑒定對Pcb有較好抑菌效果的拮抗細菌，以期為馬鈴薯細菌性軟腐病的化學防治和生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌為馬鈴薯軟腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis Po-2菌株，分離自廣東省惠東縣馬鈴薯產區，由華南農業大學細菌研究室保存并提供。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。以不加瓊脂作為液體培養基。普通細菌培養基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蔗糖15 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。供試藥劑選擇國內馬鈴薯生產上防治植物細菌性病害的9種藥劑，見表1。

表1 供試藥劑及其有效成分和廠家

1.2 試驗方法

1.2.1 單一藥劑對馬鈴薯軟腐病菌的平板抑菌試驗 各藥劑設置2個濃度，其中一個是藥劑說明書上的使用濃度，另一個是該濃度的3倍稀釋液，利用平板打孔方法，測定9種藥劑對Pcb的抑菌作用。方法如下：將Po-2單菌落接種于10 mL LB培養液中，30℃培養24 h，調整OD600約為0.5，并取1 mL菌液加入到100 mL融化的（約45℃）LB固體培養基中，充分混勻后，倒入滅菌培養皿中，制成含Pcb指示菌Po-2平板，凝固后用7 mm打孔器在平板上打孔，在孔內加入50 μL藥劑，每個藥劑濃度3次重復，以無菌水作對照。30℃培養24 h后，測量抑菌圈大小。

1.2.2 混合藥劑對馬鈴薯軟腐病菌的平板抑菌試驗 挑選單一藥劑抑菌作用效果較好的藥劑，以1∶1進行兩兩混配，進行平板抑菌試驗，方法同1.2.1。

1.2.3 馬鈴薯軟腐病菌拮抗細菌分離和篩選土壤細菌分離 土壤樣本采集于華南農業大學校園及周邊環境的植物根際，土壤細菌分離方法為：稱取10 g土壤于錐形瓶中，加入50 mL無菌水，充分攪拌，靜置15～20 min，取上清液進行10倍梯度稀釋，而后取100 μL稀釋液均勻涂布在普通細菌培養基平板上，30℃培養24～48 h，挑取不同形態單菌落，多次純化，備用。

拮抗細菌平板篩選：將上述已純化的細菌菌株接種于10 mL LB中，30℃培養24 h，調整OD600約為0.5，然后取3 μL點接在新制備的Po-2平板上，方法同1.2.1。30℃培養24～48 h，測定抑菌圈大小。

1.2.4 拮抗細菌16S rDNA初步鑒定 對篩選出的拮抗細菌，采用細菌的通用引物E8F/ATCGTGCCCATCGATCACTG和1541R/CATGGATCGTCATAAAGCT，PCR擴 增 16S rDNA片段，25 μL PCR反應體系為：PCR緩沖 液 2.5 μL、dNTPs 2 μL、引物各1 μL、TaqDNA聚合酶0.4 μL、雙蒸水17.1 μL、模板1.0 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸 1.5 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化后，送上海英濰捷基生物技術公司測序，并將序列在NCBI網站上進行核酸序列Blast比對，選取同源性較高的序列用MEGA5.0軟件構建系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 萬勝清、克菌康、辛菌胺醋酸鹽、金霉唑等藥劑對馬鈴薯軟腐病菌具有較好抑菌作用

平板抑菌試驗結果（圖1）表明，9種藥劑中對軟腐病菌Po-2的抑菌作用存在差異，其中萬勝清（20%溴菌腈·5%壬菌銅）800倍抑菌圈直徑最大、平均為24.50 mm，稀釋2 400倍后抑菌圈直徑仍有19.33 mm；克菌康（3%中生菌素）600倍的抑菌圈直徑5.92 mm，稀釋1 800倍后抑菌圈直徑為3.67 mm；1.2%辛菌胺醋酸鹽稀釋200倍和600倍，其抑菌圈直徑分別為7.58和3.58 mm；金霉唑（1.5%噻霉酮）稀釋600倍和1 800倍，其抑菌圈直徑分別為6.08和2.25 mm。然而，碧生（20%噻唑鋅）、龍克菌（20%噻菌銅）、興農（33.5%喹啉銅）、可殺得叁仟（46%氫氧化銅）和銅高尚（27.12%堿式硫酸銅）等5種藥劑，在它們最小稀釋倍數范圍內對Po-2均沒有抑菌作用，抑菌圈直徑均為0.00 mm（表2）。4種藥劑最大稀釋度的抑菌試驗結果表明，對馬鈴薯軟腐病菌的抑菌效果表現為萬勝清＞克菌康＞辛菌胺醋酸鹽＞金霉唑。

圖1 藥劑萬勝清在Po-2平板上產生的抑菌圈

表2 9種藥劑對馬鈴薯Pcb菌株Po-2的平板抑菌圈直徑

2.2 辛菌胺醋酸鹽和萬勝清混配對馬鈴薯軟腐病菌的抑菌效果

將抑菌效果較好的辛菌胺醋酸鹽和萬勝清兩種藥劑混配，平板上測定對馬鈴薯軟腐病菌Po-2的抑菌作用，結果發現，辛菌胺醋酸鹽和萬勝清混配后抑菌圈直徑為25.67 mm，而單獨辛菌胺醋酸鹽抑菌圈直徑為9.17 mm，單獨萬勝清抑菌圈直徑為26.42 mm，表明這兩種藥劑混配后并不能提高抑菌效果。

2.3 馬鈴薯軟腐細菌拮抗細菌的分離和拮抗效果測定

從不同植物根際土壤中共分離出150個細菌菌株，通過平板抑菌試驗，得到5個細菌菌株對馬鈴薯軟腐細菌Po-2有抑菌作用，其抑菌圈直徑在2.75～3.83 mm之間（表3），其中拮抗菌RFjk2的抑菌作用最明顯（圖2）。

表3 5個拮抗細菌對軟腐病菌Po-2的平板抑菌圈大小

圖2 拮抗細菌RFjk2和RFjk3對馬鈴薯軟腐病菌Po-2的平板抑菌作用

2.4 5個拮抗細菌16S rDNA序列分析和初步鑒定

進一步對這5個菌株進行16S rDNA測序，采用細菌通用引物E8F/1541R PCR擴增16S rDNA片段，其目的片段大小均為1.5 kp大小。擴增產物測序后，將獲得的序列在NCBI網 站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 進行BLAST同源性檢索，計算所測定的5個菌株的16S rDNA全序列遺傳距離，對5個菌株經MEGA4軟件統計，采用鄰接法（NJ法）分別構建5個拮抗細菌的系統發育樹（圖3～圖7）。

表4 5個拮抗細菌16S rDNA序列BLAST和初步鑒定結果

結果表明，拮抗菌RFjk1與菠蘿泛生菌Pantoea ananatis 菌株SGAir0210（基因編號：CP028033.1）的16S rDNA序列同源性為99%，初步鑒定為泛生菌屬（Pantoea）（圖3、表4）；拮抗菌RFjk2與粘質沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株EG5（基因編號：KU321349.1）的16S rDNA序列同源性為100%，鑒定為粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）（圖4、表4）；拮抗菌RFjk3與殺變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida RD_MAAMIA_05（基因編號：KU597532.1）的16S rDNA序列同源性為99%，初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）（圖5、表4）；拮抗菌RFjk4和RFjk5與松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri（基因編號：LS483305.1和JX134627.1）的16S rDNA序列同源性為99%，初步鑒定為葡萄球菌屬（Staphylococcus）（圖6～圖7、表4）。

圖3 拮抗細菌RFjk1基于16S rDNA序列的系統發育樹

圖4 拮抗細菌RFjk2基于16S rDNA序列的系統發育樹

圖5 拮抗細菌RFjk3基于16S rDNA序列的系統發育樹

圖6 拮抗細菌RFjk4基于16S rDNA序列的系統發育樹

圖7 拮抗細菌RFjk5基于16S rDNA序列的系統發育樹

3 結論與討論

迄今，國內外防治作物細菌性病害的新型化學藥劑種類較少，且大多數以銅制劑為主［6］，然而，同一成分的殺細菌劑并非對所有植物病原細菌都有抑菌或殺菌作用。本研究通過室內平板抑菌試驗，發現國內市場上使用的9種殺細菌藥劑對馬鈴薯軟腐病菌Pcb的抑菌效果差異較大，其中萬勝清（20%溴菌腈·5%壬菌銅）、克菌康（3%中生菌素）、辛菌胺醋酸鹽、金霉唑（1.5%噻霉酮）等4種藥劑對Pcb菌株Po-2抑菌效果較好，而碧生（20%噻唑鋅）、龍克菌（20%噻菌銅）、興農（33.5%喹啉銅）、可殺得叁仟（46%氫氧化銅）、銅高尚（27.12%堿式硫酸銅）等5種藥劑在其使用濃度范圍內對Po-2均沒有抑菌作用。

噻霉酮主要用于防治真菌病害，未報道其對軟腐病細菌有作用，本研究發現，1.5%噻霉酮對馬鈴薯軟腐菌Pcb具有抑菌效果。辛菌胺醋酸鹽是一種廣譜性殺菌劑，對一些真菌、細菌及病毒病害均有一定的防治效果［7-9］，中生菌素和溴菌·壬菌銅較多地應用于植物細菌病害防治［10-11］。由此，我們認為，田間防治Pcb引起的作物細菌性軟腐病，可推薦使用萬勝清（20%溴菌腈·5%壬菌銅）、中生菌素、辛菌胺醋酸鹽和金霉唑（1.5%噻霉酮）等藥劑，萬勝清和辛菌胺醋酸鹽混配并不能提高抑菌效果，不建議在生產上混合使用，但可以輪換使用，還需要進一步的田間試驗。

噻唑鋅是新一代高效、低毒、安全的有機鋅殺菌劑，20%噻唑鋅對水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae）、大白菜軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovora）有較好的抑菌作用和病害防治效果［12-13］；噻菌銅可用于煙草野火病、柑桔潰瘍病、姜瘟病等細菌病害的防治［14-15］；喹啉銅則可用于防治黃瓜細菌性角斑病，且與烯酰嗎啉混和使用，效果更佳［16］；其他幾種銅制劑，如可殺得三仟、銅高尚等有報道用來防治水稻白葉枯病、水稻細菌性條斑病和稻曲病等［17-19］。然而，本研究卻發現，噻菌銅、喹啉銅、氫氧化銅和堿式硫酸銅等銅制劑，在它們的使用濃度范圍內，均不表現對馬鈴薯軟腐細菌Pcb的平板抑菌和殺菌作用，原因可能由于這些銅制劑本身對Pcb作用效果差，也可能生產上大量使用這些銅制劑，病菌已經產生了抗藥性，需要進一步研究。

目前，針對由Pcb引起的細菌性軟腐病的生物防治研究極少，本研究從土壤中分離獲得5個對軟腐細菌Pcb具有抑菌效果的拮抗細菌，16S rDNA序列分析表明，它們分別與菠蘿泛生菌（Pantoea ananatis）、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）、變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）及松鼠葡萄 球 菌（Staphylococcus-sciuri） 的 16SrDNA序列相似性在99%以上。有研究表明，泛生菌屬Pantoea細菌對茄鏈格孢（Alternaria solani）、辣椒枝孢（Cladosporium capsici）、稻梨孢菌（Pyricularia oryzae）、甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata）、西瓜殼二孢（Ascochyta citrullina）等病原真菌有抑菌效果［20］，成團泛菌（Pantoea agglomerans）對志賀氏菌（Shigella castellani）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（salmonella enteritidis）等病原細菌有抑制作用［21］。本研究分離得到的拮抗菌RFjk1初步鑒定為菠蘿泛生菌（Pantoea ananatis），該細菌可引起多肉葉片細菌性褐腐病［22］，但鮮見有抑菌作用的報道；拮抗菌RFjk3、RFjk4和RFjk5初步鑒定為變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri），變形假單胞菌作為自然界的常見菌，對多種污染物有較強的分解能力，常被用于污水處理［23］，同時也引起大黃魚疾病［24］；松鼠葡萄球菌廣泛分布于自然界，為條件性致病菌，可感染人及多種動物［25］，較少報道對植物病原細菌具有抑菌作用，這3個拮抗菌能否有效用于馬鈴薯軟腐病的生物防治，以及它們對環境的潛在風險性，需要進一步研究。

有報道顯示，粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）對尖孢鐮刀菌引起的黃瓜枯萎病有防治效果［26］，從魔芋中分離的粘質沙雷氏菌對魔芋軟腐病菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora和Pectobacterium chrysanthemi）有拮抗作用［27］，因此，粘質沙雷氏菌用于植物病害生物防治具有較大潛力。本研究分離獲得的具有最大抑菌圈的拮抗細菌RFjk2屬于粘質沙雷氏菌，這將為馬鈴薯軟腐病的生物防治應用奠定基礎。