英紅九號(hào)紅茶生化成分指紋圖譜初探

凌彩金，范杰文，王秋霜，周巧儀，劉淑媚

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/廣東省茶樹(shù)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2. 華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510006）

英紅九號(hào)是從云南大葉有性群體品種中單株分離，經(jīng)30多年系統(tǒng)選育而成的無(wú)性系大葉紅茶品種［1］。以英紅九號(hào)為原料加工而成的英德紅茶，可與世界上著名的印度紅茶、斯里蘭卡紅茶媲美，被茶界譽(yù)為后起之秀，同時(shí)與國(guó)內(nèi)的滇紅、祁紅被認(rèn)定為中國(guó)三大著名出口紅茶［2］。目前，英紅九號(hào)紅茶的品質(zhì)審評(píng)主要采用感官審評(píng)，即在一定的環(huán)境、設(shè)備條件下，茶葉評(píng)審人按茶葉色澤、香氣、滋味、性狀、葉底分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，以確定茶葉的品質(zhì)和等級(jí)。但是通過(guò)感官審評(píng)對(duì)英紅九號(hào)紅茶的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)定，其結(jié)果受審評(píng)環(huán)境、設(shè)備及審評(píng)員工作經(jīng)驗(yàn)等多種不穩(wěn)定因素的影響。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶葉指紋圖譜的研究主要采用高效液相色譜法（HPLC）［3］，以茶葉各色譜峰的峰面積為因子，運(yùn)用相關(guān)系數(shù)、聚類(lèi)分析等方法構(gòu)建茶葉HPLC指紋圖譜［4-5］。有研究報(bào)道，通過(guò)構(gòu)建綠茶指紋圖譜可用于預(yù)測(cè)綠茶的抗氧化能力［6］。但在茶葉生化成分、微量元素等常規(guī)理化指標(biāo)方面而構(gòu)建的指紋圖譜研究較少。本研究采用國(guó)家茶葉標(biāo)準(zhǔn)中的方法測(cè)定春、夏、秋三季英紅九號(hào)紅茶常規(guī)生化成分的含量，分析不同季節(jié)各生化成分的差異，構(gòu)建數(shù)字化的英紅九號(hào)紅茶生化成分指紋圖譜，為英紅九號(hào)紅茶的常規(guī)生化成分指紋圖譜的構(gòu)建提供參考，在區(qū)分英紅九號(hào)與其他品種紅茶，對(duì)不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶進(jìn)行分類(lèi)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

春、夏、秋三季英紅九號(hào)紅茶樣本由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供，共23個(gè)樣品；另有來(lái)自其他企業(yè)的6個(gè)紅茶茶樣作為對(duì)照樣品（表1）。茶葉采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，茶樣采摘、加工處理后密封貯存，貯存條件按GB/T 30375-2013 執(zhí)行［7］。

試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、堿式醋酸鉛、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、硫酸、鹽酸、茚三酮、氯化亞錫、蒽酮，均為分析純；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

儀器：AE200型分析天平（上海梅特勒-托利多公司）、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）、PHS-3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）、725N型紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、ML-50 型快速水分測(cè)定儀（日本AND公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樣準(zhǔn)備 稱(chēng)取經(jīng)粉碎過(guò)孔徑0.250 mm篩的樣品1.000 g（精確至0.001 g），放入250 mL錐形瓶中，加入90 mL沸水，浸提45 min，每隔10 min振蕩1次。浸提完畢后，趁熱過(guò)濾，待茶湯冷卻至室溫后加水定容至100 mL，備用。

表1 樣品信息

1.2.2 理化指標(biāo)測(cè)定 水分含量測(cè)定采用快速水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定；茶多酚含量測(cè)定采用福林酚法，按GB/T 8313-2008執(zhí)行［8］；游離氨基酸總量測(cè)定采用茚三酮比色法，按GB/T8314-2013執(zhí)行［9］；咖啡堿含量測(cè)定采用紫外分光光度法，按GB/T8312-2013執(zhí)行［10］；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法［11］；水浸出物含量測(cè)定采用全量法，按GB/T8305-2013執(zhí)行［12］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件處理，用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

1.3 生化成分指紋圖譜的構(gòu)建與分析

通過(guò)對(duì)不同品種、不同季節(jié)紅茶中各生化成分含量進(jìn)行分析，檢驗(yàn)不同品種、不同季節(jié)間的生化成分含量差異。然后以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分含量為變量，運(yùn)用SAS 9.4軟件中的系統(tǒng)聚類(lèi)分析（離差平方和法）對(duì)29個(gè)茶樣進(jìn)行聚類(lèi)，以構(gòu)建聚類(lèi)數(shù)字化的英紅九號(hào)紅茶生化成分指紋圖譜，并對(duì)圖譜進(jìn)行分析。

具體步驟如下：（1）用標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化方法，對(duì)茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物等5項(xiàng)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；（2）計(jì)算樣品的離差平方和；（3）采用WARD法得到樣品間的平方距離，依據(jù)不同的聚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)（半偏R2），對(duì)各樣本進(jìn)行聚類(lèi)，并作出聚類(lèi)譜系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化成分含量

采用國(guó)家茶葉標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定了春、夏、秋三季英紅九號(hào)紅茶與對(duì)比茶樣的常規(guī)生化成分含量，結(jié)果見(jiàn)表2；對(duì)春、夏、秋三季英紅九號(hào)紅茶的水分、茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。另外，對(duì)英紅九號(hào)春茶、云南滇紅春茶及凌云白毫春茶3個(gè)紅茶品種的各種生化成分含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 春、夏、秋三季英紅九號(hào)紅茶與對(duì)比茶樣的生化成分含量（%）

表3 英紅九號(hào)紅茶不同季節(jié)間各生化成分含量差異性分析

表4 不同品種紅茶生化成分含量差異性分析

2.1.1 茶多酚 從表2可以看出，英紅九號(hào)紅茶的茶多酚含量為14.15%，其中夏季英紅九號(hào)的茶多酚含量最高、為17.31%，春季的茶多酚含量最低、為13.40%，英紅九號(hào)紅茶的茶多酚含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季（表2）。已有研究表明，在其他因素較一致的情況下，氣溫、日照影響著鮮葉中生化成分的含量變化［13］，而茶多酚的基本規(guī)律為溫度和光照有利于茶多酚物質(zhì)的積累［14］。

采用SPSS19.0軟件對(duì)英紅九號(hào)春、夏、秋三季紅茶的茶多酚含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表3）顯示，英紅九號(hào)紅茶不同季節(jié)間茶多酚含量差異極顯著。對(duì)英紅九號(hào)春茶、云南滇紅春茶及凌云白毫春茶3個(gè)紅茶品種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表4）顯示，不同品種紅茶間茶多酚含量差異顯著。

2.1.2 氨基酸 不同季節(jié)的英紅九號(hào)紅茶的氨基酸含量為4.00%，其中夏季英紅九號(hào)的氨基酸含量最高、均值為4.13%，春季的氨基酸含量最低、均值為3.85%，英紅九號(hào)紅茶的氨基酸含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季（表2）。氨基酸是重要的滋味物質(zhì)［15］，其含量則茶葉滋味鮮醇、香氣也好［16］。一般來(lái)說(shuō)，春茶氨基酸含量高于夏秋茶，春茶的滋味也因此更鮮爽、香氣更加濃烈。本研究中，春季英紅九號(hào)紅茶的氨基酸含量略低于夏秋季，可能因種植過(guò)程中受氣溫、雨量等氣候因素的影響所致。

對(duì)英紅九號(hào)春、夏、秋三季紅茶的氨基酸含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表3）顯示，英紅九號(hào)紅茶不同季節(jié)間氨基酸含量無(wú)顯著性差異。對(duì)英紅九號(hào)春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個(gè)紅茶品種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表4）顯示，不同品種紅茶間氨基酸含量差異極顯著。

2.1.3 咖啡堿 不同季節(jié)的英紅九號(hào)紅茶的咖啡堿含量為3.20%，其中夏季英紅九號(hào)的咖啡堿含量最高、均值為3.79%，秋季的咖啡堿含量最低、均值為3.05%，英紅九號(hào)紅茶的咖啡堿含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞春季＞秋季（表2）。茶葉中的咖啡堿含量與茶樹(shù)的生長(zhǎng)條件、品種、產(chǎn)地、加工方法和采收期等諸多因素相關(guān)，一般規(guī)律是遮光條件下栽培的茶樹(shù)咖啡堿含量較高，細(xì)嫩茶葉比粗老茶葉含量高，夏茶比春茶含量高［17］，本研究結(jié)果與此規(guī)律相符。

對(duì)英紅九號(hào)春、夏、秋三季紅茶的咖啡堿含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表3）顯示，英紅九號(hào)紅茶不同季節(jié)間咖啡堿含量差異極顯著。對(duì)英紅九號(hào)春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個(gè)紅茶品種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表4）顯示，不同品種紅茶間咖啡堿含量無(wú)顯著差異。

2.1.4 可溶性糖 不同季節(jié)的英紅九號(hào)紅茶的可溶性糖含量為3.19%，其中春季英紅九號(hào)的可溶性糖含量最高、均值為3.70%，夏季的可溶性糖含量最低、均值為2.74%，英紅九號(hào)紅茶的可溶性糖含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為春季＞秋季＞夏季（表2）?？扇苄蕴鞘遣铚侍鹞兜闹饕镔|(zhì)，可緩解茶多酚、咖啡堿造成的茶湯苦澀味。春季英紅九號(hào)的可溶性糖高于夏季及秋季，故英紅九號(hào)春茶的滋味更香甜［18］。

對(duì)英紅九號(hào)春、夏、秋三季紅茶的可溶性糖含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表3）顯示，英紅九號(hào)紅茶不同季節(jié)間可溶性糖含量無(wú)顯著差異。對(duì)英紅九號(hào)春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個(gè)紅茶品種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表4）顯示，不同品種紅茶間可溶性糖含量差異顯著。

2.1.5 水浸出物 不同季節(jié)的英紅九號(hào)紅茶的水浸出物含量為40.49%，其中夏季英紅九號(hào)的水浸出物含量最高、均值為42.36%，春季的水浸出物含量最低、均值為36.95%，英紅九號(hào)紅茶的水浸出物含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季（表2）。水浸出物的主要成分是茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水溶色素、水溶性果膠、可溶性蛋白、維生素和無(wú)機(jī)鹽等［19-21］。

對(duì)英紅九號(hào)春、夏、秋三季紅茶的水浸出物含量進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表3）顯示英紅九號(hào)紅茶不同季節(jié)間水浸出物含量差異顯著。對(duì)英紅九號(hào)春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個(gè)紅茶品種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（表4）顯示，不同品種紅茶間水浸出物含量無(wú)顯著性差異。

2.2 生化成分指紋圖譜的構(gòu)建與分析

通過(guò)對(duì)不同品種、不同季節(jié)紅茶中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同品種的生化成分含量存在差異，不同季節(jié)間的英紅九號(hào)的生化成分含量也存在差異。因此，本研究以這5種生化成分含量為變量，運(yùn)用SAS 9.4軟件中的系統(tǒng)聚類(lèi)分析（離差平方和法）對(duì)29個(gè)茶樣進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖 1。

結(jié)果顯示，在不同的聚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)（半偏R2）下，聚類(lèi)結(jié)果不同，當(dāng)半偏R2為0時(shí)，每個(gè)樣品為單獨(dú)的一類(lèi)；隨著半偏R2標(biāo)準(zhǔn)逐漸放大，29個(gè)區(qū)域單位被依次聚類(lèi)。當(dāng)半偏R2為0.25時(shí)，29個(gè)區(qū)域被聚為9類(lèi)，其中夏季英紅九號(hào)紅茶1號(hào)和2號(hào)為一類(lèi)，春季英紅九號(hào)19、20和22號(hào)為一類(lèi)，秋季英紅九號(hào)9、10和12號(hào)為一類(lèi)，秋季英紅九號(hào)4、5、13和15號(hào)為一類(lèi)。聚類(lèi)結(jié)果（圖1）表明，英九的春、夏、秋三季紅茶各生化成分含量存在差異。同時(shí)，當(dāng)半偏R2為0.25時(shí)，凌云白毫紅茶28號(hào)和29號(hào)聚為一類(lèi)，云南滇紅23、24、25和26號(hào)為一類(lèi)，這說(shuō)明在茶葉生化成分含量上，英紅九號(hào)紅茶、凌云白毫及云南滇紅有明顯區(qū)別。

圖1 29個(gè)茶葉樣品的系統(tǒng)聚類(lèi)譜系

由此可見(jiàn)，茶葉中各生化成分含量可作為不同季節(jié)、不同品種紅茶聚類(lèi)的依據(jù)。以各生化成分含量為變量的聚類(lèi)分析能對(duì)不同季節(jié)的英紅九號(hào)紅茶進(jìn)行歸類(lèi)，也能準(zhǔn)確地區(qū)分英紅九號(hào)紅茶與其他品種。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用國(guó)家茶葉標(biāo)準(zhǔn)中的方法測(cè)定了不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶和其他品種紅茶的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物5種生化成分的含量。差異性分析發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶的茶多酚、咖啡堿、水浸出物含量差異顯著；不同品種紅茶的茶多酚、氨基酸、可溶性糖含量差異顯著。以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖和水浸出物含量為因子，用聚類(lèi)分析的方法建立數(shù)字化英紅九號(hào)紅茶生化成分指紋圖譜，在區(qū)分英紅九號(hào)與其他品種紅茶、不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶進(jìn)行歸類(lèi)方面具有可行性。

茶樹(shù)作為一種多年生植物，其芽葉中所含的內(nèi)質(zhì)成分與成茶品質(zhì)有著密切的關(guān)系。本試驗(yàn)中，春、夏、秋三季的英紅九號(hào)紅茶的茶多酚、游離氨基酸和水浸出物含量隨著季節(jié)的不同而產(chǎn)生差異，總體表現(xiàn)均為夏季含量最高，春季含量最低；可溶性糖含量總體表現(xiàn)為春季最高，夏季最低；英紅九號(hào)3個(gè)季節(jié)中的茶多酚、咖啡堿及水浸出物含量存在明顯差異。不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶生化成分產(chǎn)生差異的原因在于茶樹(shù)因生長(zhǎng)所處的季節(jié)不同，溫濕度、降水量、日照時(shí)間及強(qiáng)度等的差異會(huì)對(duì)其新梢所含生化成分產(chǎn)生一定的影響。不同品種間，英紅九號(hào)紅茶、云南滇紅及凌云白毫春茶的茶多酚、氨基酸及可溶性糖的含量存在顯著差異，說(shuō)明不同品種間春茶的生化成分組成存在一定的差異，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［22］。

在系統(tǒng)聚類(lèi)分析中，當(dāng)半偏R2為0.25時(shí)，能夠區(qū)分春、夏、秋三季英紅九號(hào)紅茶以及其他品種紅茶，茶樣中的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分可作為作為不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶、不同品種紅茶聚類(lèi)的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室曾采用HPLC法對(duì)英紅九號(hào)、云南滇紅及凌云白毫品種加工制造的紅茶產(chǎn)品進(jìn)行分析測(cè)定，以各色譜峰的峰面積為引子，采用聚類(lèi)分析方法構(gòu)建了鑒定不同品種及不同季節(jié)英紅九號(hào)紅茶的HPLC指紋圖譜分析方法［4］。本試驗(yàn)分析結(jié)果中，與前期通過(guò)高效液相色譜法得出的系統(tǒng)聚類(lèi)譜系圖存在差異，分析原因是由于聚類(lèi)依據(jù)的不同而產(chǎn)生的差異。本試驗(yàn)是以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分含量作為聚類(lèi)依據(jù)，HPLC指紋圖譜中是以兒茶素類(lèi)化合物（C、EC、CG、GC、EGC等）的色譜峰面積作為聚類(lèi)依據(jù)。此外也有研究表明，采用不同的聚類(lèi)方法，對(duì)于相同的數(shù)據(jù)可能有不同的劃分結(jié)果，劃分結(jié)果也會(huì)隨選擇距離的不同而存在差異［23］。本試驗(yàn)采用的聚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)（半偏R2）與HPLC指紋圖譜采用的聚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)（歐氏距離）不同，這也有可能是造成聚類(lèi)譜系圖差異的原因之一。但總體而言，通過(guò)不同數(shù)據(jù)的聚類(lèi)分析，都可以得出不同季節(jié)的英紅九號(hào)紅茶在內(nèi)質(zhì)成分的含量上存在一定的差異，可應(yīng)用于英紅九號(hào)紅茶指紋圖譜研究。