陽江地區某豬場塞內卡病毒抗原和抗體的檢測與分析

黃 元，劉 濤，陳錦良，王曉虎，陳 晶，梁培新，黃 武，向 華

（1.廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省獸醫公共衛生公共實驗室/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農業部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640；2.廣東源豐農業有限公司，廣東 陽江 529938；3.廣東宏豐農牧有限公司，廣東 英德 513036 ）

塞內卡病毒病是由小核糖核酸病毒科塞內卡病毒屬的塞內卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一種主要感染豬的病毒性傳染病。病毒直徑約為25～30 nm，正二十面體結構，分子結構為單股正鏈非分段RNA［1］。該病毒可引起豬產生類似水皰樣病變，感染豬的鼻吻、蹄冠等部位［2］，臨床上出現鼻孔囊泡破裂和侵蝕，蹄冠狀動脈帶囊泡破裂后會導致豬只跛行［3］。美國、巴西等地的臨床研究表明，1周齡仔豬感染SVA后，臨床表現為肥胖、肌無力、食欲不振、嗜睡、唾液分泌過多、皮膚充血、腹瀉，并且有神經系統表現，有些仔豬會突然死亡。臨床癥狀一般持續3～10 d，然后在存活的仔豬中消失。對仔豬進行常規剖檢，表現為腎臟淤點出血，舌頭出現潰瘍性損傷［4］。該病本身死亡率不高，但易造成繼發感染，可致仔豬死亡率高達30%～70%［5］。由于與口蹄疫等水皰性疾病難以區分，容易造成恐慌。

塞內卡病毒最初引起人們的注意是在胎牛血清或胰酶污染的細胞培養液中［6］。2008年SVA在美國的豬群中發現，繼而席卷美國、加拿大、巴西、澳大利亞、新西蘭、泰國、哥倫比亞等國家［7］，在世界范圍內引起廣泛關注。2015年我國廣東首次發現SVA，目前SVA已在我國多個省市暴發［8-10］。但我國對SVA的臨床報道仍然很少，對其發病豬群的抗體水平也未見檢測分析數據。

2017年4月，廣東省陽江地區某豬場發生疑似塞內卡病毒感染癥狀。為進一步了解SVA為防控積累數據，本研究對該豬場采集的患病組織和血清進行病毒分離，建立了微量血清抗體中和試驗方法，并進行了抗原和抗體檢測分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的疑似SVA發病豬蹄部水泡皮和16份豬血清均來自廣東省陽江地區某豬場。

主要試劑：TakaRa ExTaq DNA聚合酶、pMD19-T質粒和DH5α感受態細胞，購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒小量快速抽提試劑盒，購自美基生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RT-PCR檢測 水泡皮研磨后離心10 min（12 000 r/min，4℃）， 取 上 清， 用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取病毒總核酸進行RT-PCR檢測。引物按照文獻［11］合成，針對VP1-2A基因，上游引物序列為5’-TCGGTTTACTCCGCTGATGGTTGG-3’；下游引物序列為5’-AGGACCAGGATTGGTCTCGATATC-3’。RT-PCR反應條件：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1.5 min，35 個循環；72℃ 5 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.2 基因克隆和序列測定 PCR產物電泳后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收980 bp左右的片段，連接至pMD19-T載體，用質粒小量快速抽提試劑盒提取質粒，由華大基因公司測序。對核苷酸序列進行BLAST在線分析，并用MEGA6軟件與GenBank上下載的參考毒株進行序列比對分析。

1.2.3 病毒分離及滴度測定 水泡皮研磨后離心10 min（12 000 r/min，4℃），上清液用0.22 μm濾器過濾后接種至PK-15細胞，培養5 d后若無病變產生則凍融3次再次接種細胞，產生病變后的培養產物在PK-15細胞上進行病毒傳代，培養產物10倍梯度稀釋后接種96孔板，測定對PK-15細胞的TCID50［7］，72 h后觀察病變，以K?rber法計算結果。

1.2.4 微量血清抗體中和試驗 按照文獻［12］的方法進行微量血清抗體中和試驗。將待測血清于56℃下水浴1 h，以除去血清中的補體及其他干擾物質。處理后的待測血清用含2%胎牛血清的MEM培養液進行2倍梯度稀釋，然后在96孔細胞培養板中每孔加50 μL；病毒液稀釋至100 TCID50/50μL，每孔加入50 μL，于37℃二氧化碳培養箱中放置1 h后加入PK-15細胞懸液，同時設立病毒回歸對照；置37℃二氧化碳培養箱中培養72 h后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR結果

從病料提取核酸進行RT-PCR，對PCR產物進行電泳，結果觀察到接近1 000 bp的單一條帶（圖1）。將PCR產物連接到pMD19-T載體，其測序結果表明，獲得長度為980 bp的VP1-2A序列。

圖1 SVA VP1-2A的RT-PCR擴增產物電泳結果

2.2 VP1-2A核苷酸序列分析

對本研究獲得的毒株命名為CHGDYJ-2017，將所克隆的VP1-2A基因序列與GenBank上的SVA同區段序列進行比對分析，建立系統進化樹（圖2）。與 CH-GDYJ-2017同源性最高的是2015年美國毒株USA/GBI29/2015（KT827251），同源性為99.2%；同源性最遠的是2008年美國毒株SVV-001（DQ641257），同源性為91.3%，表明結構蛋白基因VP1附近仍舊是變異較快的區域，但并未顯現明顯的時間或地域相關的變異特征。

在我國流行毒株中，與本研究獲得的毒株CH-GDYJ-2017關系最近的是CH-HN-2017（97.1%），最遠的是CH-01-2015（92.2%），表明我國的SVA病毒已經在多地流行并且呈現一定的變異趨勢。

圖2 SVA VP1-2A核苷酸序列系統進化樹

2.3 病毒分離及滴度測定結果

將水泡皮處理產物接種PK-15細胞后，盲傳4代后產生明顯細胞病變。在PK-15細胞上傳代4次后測定病毒滴度，滴度可達107TCID50/0.1mL。

2.4 抗體中和試驗結果

從采集的16份血清樣本數據來看，無論豬只發病與否，均有中和抗體出現（表1），說明均有過感染。9頭種豬全部感染SVA，其中6頭發病，發病率為66.7%。按抗體效價大于等于1∶64為陽性計算［13］，受檢的16份樣品中有11份陽性，總感染率為68.8% 。6頭發病種豬的中和抗體效價非常高，3頭臨床未發病的種豬的抗體效價也都達到了1∶1 024以上，最高達1∶4 096。

表1 抗體中和試驗結果

3 結論與討論

塞內卡病毒（SVA）作為一種新的外來病原，已經在我國部分地區流行，未來幾年可能會繼續呈現蔓延的趨勢，由于當前市場尚無SVA疫苗出售，隨著傳播范圍的擴大，必將造成更大的經濟損失［14］。雖然其危害沒有口蹄疫那樣嚴重，但是由于其臨床癥狀與口蹄疫極其類似，因此，為了鑒別和區分，避免不必要的恐慌，做好疫病的預防和監控迫在眉睫。相關部門應及時關注國內外疫情相關動態，掌握塞內卡病毒的流行趨勢及其帶來的環境風險，確保第一時間對SVA進行合理的應對和處置。

本次抽檢的16份血清樣本全部來自廣東陽江某豬場。從中和試驗的結果來看，抗體陽性率為68.8%（≥1∶64）。其中種豬抗體陽性率為100%，抗體效價均達到1∶1 024以上，未發病豬抗體陽性率為50%。說明SVA的免疫原性很強，能夠刺激動物機體產生很高的抗體水平。發病豬中和抗體效價非常高，與FMD臨床發病相比，SVA臨床發病豬康復快，與臨床實際相一致。這次豬場發病均為種豬，未見哺乳仔豬、保育豬、肥豬發病。這與國外文獻報道的仔豬死亡率高不一致［4-5］。因此我們檢測了除母豬以外的其他階段豬的中和效價，發現多個階段豬均有感染，只是未見臨床表現，后續將進一步加強臨床觀察和深入研究其具體原因。

本研究從廣東陽江地區某豬場的疑似病料中檢出SVA并進行分離，建立了微量血清抗體中和試驗方法，為SVA的流行病學研究提供了工具［15］。對同為小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒（FMDV）的研究表明，FMDV的抗原具有高度變異性［16-17］，病毒核衣殼的變異順序為VP1＞VP2＞VP3＞VP4，由于VP1基因的核苷酸易發生變異，因此，在分子流行病學調查中可通過比較分析VP1基因的核苷酸序列之間的差異來分析各毒株之間的變異情況，為研究不同毒株的親緣關系奠定基礎［17］。SVA與FMDV同屬小核糖核酸病毒科，在核苷酸序列分析上可以采用同樣的方法［18］。對VP1基因測序比對的結果表明，分離株與美國2015年毒株USA/GBI29/2015同源性較高（99.2%），而與我國毒株同源性最高僅為97.1%（2017年毒株CH-HN-2017）。從系統進化樹來看，目前我國流行毒株已經產生多個分支。這表明SVA可能先后多次傳入我國［19］。此外，廣東株（CH-01-2015）和湖北株（HB-CH-2016）序列比對同源性為100%，說明這兩個地區之間毒株傳播迅速，短期內就已經跨越多個省份，需要更加密切關注SVA在我國其他省份的流行情況［20］。我國對外來疫病的防控制度和應對措施還需要進一步完善［15］。本研究選取不同國家和我國不同地區不同時間段具有代表性的毒株，對部分序列遺傳關系進行分析，如需獲得更加準確的遺傳進化關系，可對各流行毒株的全基因組序列進行全面系統的分析。