紅三葉根際溶磷菌的篩選與培養基優化

李海云，姚拓*，張榕，張潔，李智燕，榮良燕，路曉雯，楊曉蕾，夏東慧，羅慧琴

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省草原技術推廣總站，甘肅 蘭州 730010)

植物根際促生菌在土壤肥力形成、營養循環、植物生長等方面發揮著重要作用[1]。促生菌的促生作用[主要有固氮、分泌吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、溶磷和生防效果等]主要體現在改善植物根際營養環境，分泌促生物質以及提高寄主對非生物脅迫的忍耐力等方面[2-3]。利用從不同植物根際分離、篩選的優良促生菌資源研制的微生物菌肥，與化肥、農藥相比，微生物菌肥具有成本低、增產穩定、非再生能源消耗少，對生態環境友好、農產品安全，經濟效益高等優點[4]。因此，植物根際促生菌種資源的篩選成為人們關注的熱點。目前，針對玉米(Zeamays)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、小麥(Triticumaestivum)[7-8]等作物根際促生菌資源的篩選研究較多，而對于牧草相關研究卻鮮有報道。岷山紅三葉(Trifoliumpratense)是一種藥草兼用型優質豆科牧草，其粗蛋白和異黃酮含量是玉米和大豆(Glycinemax)的2.3和10.0倍，是異黃酮提取的優質原料[9]。近年來，為追求經濟效益，種植者將大量工業磷肥和農藥施用于岷山紅三葉，這一措施雖取得了一定的成效，但存在很多問題[10]，如增加岷山紅三葉的種植成本，土壤肥力下降，天然草場土壤微生物區系多樣性破壞以及環境污染等[11]。而植物根際溶磷菌可以把土壤中不能被植物利用的無機磷轉化為植物可利用的有機磷，促進植物磷素的供應和生長[12]。因此，從岷山紅三葉根際土壤中篩選出具有溶磷、生防能力的菌株，將其制成微生物磷肥，以實現部分替代工業磷肥的目標具有重要意義。目前溶磷菌株通常采用Pikovaskaia’s(PKO)培養基進行篩選，根據溶磷菌在PKO培養基上形成的溶磷圈初步判斷菌株的溶磷能力[13]。但是有些溶磷菌在該培養基上形成的溶磷圈很小，但其溶解無機磷酸鹽的能力卻較強。為解決這一問題，Gupta等[14]在PKO培養基中加入了溴苯酚，以提高溶磷圈的清晰度和透明度，卻并沒有有效解決這一問題。林啟美等[15]，齊文娟等[16]研究發現，該培養基中Fe、Mn、Na等金屬離子的存在對溶磷菌溶磷能力的發揮具有一定的限制作用。因此，本研究采用PKO、PKOC1和PKOC2溶磷培養基對岷山紅三葉根際溶磷菌進行篩選和優良溶磷菌株鑒定，并對分離篩選效果較好的PKOC2培養基進行響應面優化，為岷山紅三葉根際促生菌特性研究及制備生物菌肥提供基礎資料和菌種資源支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1采樣地概況及樣品采集 采樣地位于甘肅省定西市岷縣岷山紅三葉培育基地，地理位置為北緯34°07′34″-34°45′00″，東經103°41′29″-104°59′23″，屬于典型的高寒陰濕區，適宜岷山紅三葉生長，是我國岷山紅三葉的主要培育區和種植區。海拔2493 m，年均降水量約為700 mm，無霜期112 d，年均氣溫5.8 ℃，年均日照2228.6 h。試驗區土壤為亞高山草甸土，土壤pH為7.4～7.8，有機質含量11.8 g·kg-1，有效氮95.05 mg·kg-1，有效磷7.32 mg·kg-1，有效鉀182.8 mg·kg-1。2013年5和7月采集岷山紅三葉的根系及根際土壤，裝入無菌樣品采集袋中，帶回實驗室進行菌株分離。

1.1.2培養基 采用Pikovaskaia’s(PKO)、PKOC1[17]和PKOC2[17]3種溶磷培養基，對紅三葉根際土壤溶磷菌株進行初篩；LB培養基用于菌株的活化與保存。1)PKO培養基配方為：蔗糖 10 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO40.1 g，MnSO40.002 g，FeSO40.002 g，酵母膏 0.5 g，瓊脂 18 g，補加蒸餾水至1.0 L，調節pH至6.8～7.0；2)PKOC1培養基配方為：葡萄糖 10 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO40.002 g，FeSO40.002 g，瓊脂 18 g，補加蒸餾水至1.0 L，調節pH至6.8～7.0；3)PKOC2培養基配方為：葡萄糖 10 g，Ca3(PO4)25 g，MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，瓊脂 18 g，補加蒸餾水至1.0 L，調節pH至6.8～7.0；4)LB培養基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，瓊脂 18 g，補加蒸餾水至1.0 L，調節pH至7.0。

1.2 溶磷菌篩選

準確稱取10 g紅三葉根際土壤樣品裝入250 mL三角瓶中，加入90 mL無菌水及玻璃珠，在室溫條件下200 r·min-1振蕩30 min。采用稀釋法將菌懸液涂布于PKO、PKOC1和PKOC2培養基，各3次重復，在28 ℃條件下進行培養。培養期間，觀察平板上菌落生長及菌落周圍透明圈變化情況，挑取培養基上形成的透明圈較為明顯的單個菌落，進一步通過劃線進行純化。將各菌株重新接種到PKO培養基上，各3次重復。28 ℃條件下培養13 d，分別在第5、7、9、11、13天觀察并記錄透明圈的大小，并計算D/d值[D為溶磷圈直徑(cm)，d為菌落直徑(cm)]，根據D/d值初步判斷各菌株的溶磷能力，并將菌株接種于LB斜面培養基上，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 優良溶磷菌株鑒定

將保存的優良溶磷菌株在LB平板上進行活化，采用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對菌株基因組DNA進行提取。采用細菌16S rRNA基因特異性引物27 F和1492 R[14]進行PCR擴增。PCR體系為50 μL：DNA模板2 μL，2×Taq PCR預混酶 25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應參數為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃總延伸5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將擴增產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。所測基因序列在NCBI數據庫中進行同源性序列比對，并采用MEGA 5.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹，自展值為1000次。

1.4 溶磷培養基優化

1.4.1最佳影響因子選擇 在150 mL三角瓶中，分別配制PKOC2培養基成分MgCl2添加量(2.5，5.0，10.0 g)，葡萄糖添加量(5，10，20 g)和(NH4)2SO4添加量(0.10，0.25，0.50 g)的培養基50 mL，以及采用不同碳源(果糖、半乳糖、甘露醇、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和蜜三糖)代替葡萄糖的培養基50 mL，各處理3次重復。在121 ℃滅菌20 min，在培養液中接種供試菌株MHS30菌懸液，28 ℃培養13 d后，將培養液8500 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液，采用鉬銻抗比色法測定菌液中有效磷增量(扣除對照組的有效磷增量)[17]。

1.4.2響應面優化 根據確定的PKOC2培養基成分中主要影響因子的濃度范圍，以供試菌株的相對溶磷率為響應值，采用Design-expert 8.0.6軟件中的Central composite design(CCD)試驗設計方法和響應面分析對PKOC2培養基成分的重要影響因子進行優化，因素水平設計見表1。試驗結果利用Design-expert 8.0.6軟件進行統計分析，利用各因子兩兩交互響應面、等高線以及響應面回歸模型進行優化，找出供試菌株的最大溶磷量對應各因子的最優值，并進行驗證試驗。

表1 中心組合試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of central composite design

1.5 數據處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行顯著性檢驗和多重比較分析，軟件Design-expert 8.0進行響應面優化及回歸方程方差分析。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌株初篩結果

利用3種不同溶磷培養基篩選岷山紅三葉根際溶磷菌，從紅三葉根際分離篩選出26株具有溶磷能力的菌株，部分平板初篩結果見表2。培養至第13天時，以D/d>2為衡量標準，PKO、PKOC1和PKOC2培養基分別可以獲得溶磷能力較好菌株2、4和6株?？梢姴捎肞KOC1和PKOC2培養基的效果要優于PKO培養基，這兩種培養基可以從岷山紅三葉根際分離獲得更多的高效溶磷菌株。此外，利用3種培養基分離篩選岷山紅三葉根際溶磷菌，不但工作量大，而且菌株鑒定比較困難。因此有必要對上述培養基的組分加以優化，本研究下一步選擇對分離篩選岷山紅三葉根際溶磷菌效果較好的PKOC2培養基進行成分優化。

2.2 優良溶磷菌株鑒定

對分離自紅三葉根際土壤中的7株優良溶磷菌株進行16S rRNA基因序列鑒定，通過與現已報道的16S rRNA基因序列進行相似性比對分析。根據16S rRNA基因序列系統發育樹分析鑒定結果表明(圖1)：菌株MHS4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)；菌株MHS7和MHS19為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；菌株MHS27為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；菌株MHS30為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)；菌株MHS31為蓋氏假單胞菌(Pseudomonasgessardii)；菌株MHS49為產酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。

表2 部分溶磷菌平板初篩結果Table 2 The primary screening results of phosphate-solubilizing strains

注：同列數據后不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Values followed by different lowercase letters within the same column indicate significant differences atP<0.05 level among treatments, the same below.

2.3 最佳因子選擇

表3結果表明，采用果糖、半乳糖、甘露醇、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蜜三糖等碳源代替葡萄糖時，培養基的溶磷量均低于碳源葡萄糖。當葡萄糖濃度為20 g·L-1時，隨著MgCl2濃度的增加(2.5～10 g·L-1)，培養基的相對溶磷率呈現出先增大后減小的趨勢(118.0%→122.5%→71.7%)；當MgCl2濃度為10.0 g·L-1時，隨著葡萄糖濃度的增加(5～20 g·L-1)，培養基的相對溶磷率呈現出先增大后減小的趨勢(73.2%→105.6%→71.7%)；當MgCl2濃度為2.5 g·L-1時，隨著葡萄糖濃度的增加(5～20 g·L-1)，培養基的溶磷率一直呈現增大的趨勢(55.6%→92.6%→118.0%)；當葡萄糖濃度為10 g·L-1時，隨著(NH4)2SO4濃度的增加(0.1～5.0 g·L-1)，培養基的相對溶磷率呈現出先增大后減小的趨勢(86.6%→107.5%→102.1%)。由此可知，葡萄糖、MgCl2和硫酸銨添加量對PKOC2培養基的溶磷能力具有顯著影響，是該培養基成分的主要影響因子。

2.4 CCD試驗設計與分析

2.4.1CCD試驗設計 以供試菌株MHS30溶磷量(P-solubilization capacity)為響應值(Y)，通過CCD試驗設計篩選出葡萄糖、MgCl2和(NH4)2SO4三個影響因子的最佳添加量(表4)。由表5分析結果表明：該模型極顯著(P<0.01)，說明回歸模型可用。方差分析失擬項為0.7319>0.05，說明所得的回歸方程與實際擬合中非正常誤差所占的比例較小。另外，確定系數R-Sq與Adj.R-squared分別為95.74%和91.91%，二者差距較小。從預測結果的整體估計來看，R-Sq和Pred.R-squared分別為95.74%和84.48%，說明該模型擬合度較好。同時，變異系數為2.72，說明試驗可信度較高。得到的回歸方程為：Y=273.62+6.75A+5.58B+4.28C-1.82AB-11.04AC+12.88BC-9.63A2-9.92B2-12.22C2。該回歸模型中的一次項A(葡萄糖)、B(MgCl2)對菌株的溶磷能力有極顯著影響(P<0.01)，C[NH4)2SO4]對菌株的溶磷能力有顯著影響(P<0.05)，并且影響的程度從大到小依次為：A(葡萄糖)>B(MgCl2)>C[(NH4)2SO4]。此外，二次項A2、B2和C2也會對溶磷能力產生顯著影響(P<0.01)。上述結果表明，該模型為溶磷培養基的篩選提供了可靠的模型，可利用Design-expert軟件優化回歸方程，預測3個因素的最優參數。

圖1 基于16S rRNA基因序列構建的菌株與相近種之間的系統進化樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the relationships among representative strains and their closely related type strains

培養基組成Medium component相對溶磷率P-solubilization rate培養基組成Medium component相對溶磷率P-solubilization rate對照Contrast (PKOC2)100.0±0.3ePKOC2 (果糖Fructose, 5 g)40.1±0.8kPKOC158.9±0.4iPKOC2 (半乳糖Galactose, 5 g)45.9±0.6jPKO49.1±0.3jPKOC2 (甘露醇Mannitol, 5 g)28.7±0.6mPKOC2 (葡萄糖Glucose 5 g;MgCl2 2.5 g)55.6±0.3ijPKOC2 (木糖Xylose, 5 g)89.2±0.7gPKOC2 (葡萄糖Glucose 5 g;MgCl2 5.0 g)57.3±0.5iPKOC2 (蔗糖Sucrose, 5 g)41.5±0.3kPKOC2 (葡萄糖Glucose 5 g;MgCl2 10.0 g)73.2±0.6hPKOC2 (麥芽糖maltose, 5 g)32.4±0.5lPKOC2 (葡萄糖Glucose 10 g,MgCl2 2.5 g)92.6±0.5fPKOC2 (乳糖Lactose, 5 g)73.0±0.5hPKOC2 (葡萄糖Glucose 10 g,MgCl2 10.0 g)105.6±0.5dPKOC2 (蜜三糖Raffinose, 5 g)27.8±0.4mPKOC2 (葡萄糖Glucose 20 g,MgCl2 2.5 g)118.0±0.7bPKOC2 [(NH4)2SO4 0.1 g]86.6±0.4gPKOC2 (葡萄糖Glucose 20 g,MgCl2 5.0 g)122.5±1.1aPKOC2 [(NH4)2SO4 2.5 g]107.5±0.6cPKOC2 (葡萄糖Glucose 20 g,MgCl2 10.0 g)71.7±0.4hPKOC2 [(NH4)2SO4 5.0 g]102.1±0.1c

2.4.2響應面分析 由圖2可以發現，葡萄糖與氯化鎂濃度兩因素之間的交互作用不顯著(P>0.05)；葡萄糖與硫酸銨濃度的交互作用極顯著(P<0.01)；氯化鎂與硫酸銨濃度之間的交互作用也極顯著(P<0.01)，響應曲面和等高線的分析結果與方差分析所得的結果一致。PKOC2培養基最佳組分的預測由Design-expert通過求回歸方程最大值，當最大響應值Y(溶磷量)為276.77 μg·mL-1時，對應的自變量A(葡萄糖)、B(MgCl2)和C[NH4)2SO4]分別為18.19、3.21和0.08 g·L-1。

表4 CCD試驗設計與結果Table 4 Design and results of central composite design

表5 回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

注：**,差異極顯著，P<0.01；*,差異顯著，P<0.05；ns,差異不顯著，P>0.05。

Note: **, difference is very significant,P<0.01; *, significant difference,P<0.05; ns, difference is not significant,P>0.05.

圖2 兩因素交互作用對菌株溶磷量影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of cross-interactions among factors on phosphate solubilization capacity of the strain

2.4.3驗證試驗 為驗證響應面預測模型的可用性和驗證回歸方程預測的可靠性，利用預測所得的最佳培養基組成進行驗證試驗，所測溶磷量為279.5 μg·mL-1，與預測值相近，因此該模型具有較好的可信度，可用于后續試驗。

3 討論與結論

高效溶磷菌可以有效轉化土壤中不易被植物直接吸收利用的無機磷[4]，提高土壤難溶磷的有效性和磷肥的利用效率，對促進植物生長具有重要意義。本研究發現同一株溶磷菌在不同的溶磷培養基上其溶磷能力差異較大，就菌株MHS30而言，在PKO、PKOC1和PKOC2培養基上D/d值分別為1.44、1.95和2.90，究其原因主要與培養基的組成及添加量有關，故溶磷培養基的優化對篩選出高效溶磷菌株顯得尤為重要。溶磷微生物正常的生長繁殖，不僅需要充足的碳源物質，而且還需要氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵等無機鹽成分，有些微生物還需要特殊的生長因子[18]。對于溶磷培養條件的優化也早有研究，大多從C源、N源、NaCl、pH、裝液量、接種量、種齡、溫度、搖床轉速等方面來進行研究[19-22]。溶磷過程是復雜的，并不是某一因素起全部作用，而是多種因素共同作用的結果，溶磷培養條件也會因菌株的不同而異。溶磷微生物溶磷能力的大小常通過采用PKO固體培養基定性測定和PKO液體培養基定量測定[13]。用溶磷圈法定性判定菌株是否具有溶磷能力存在一定的局限性，這有可能是因為不同有機酸擴散機理不同。相對于溶磷圈法定性判定溶磷菌的溶磷能力，液體培養定量測定方法更為合理和科學[19,22]。然而另有研究證明PKO培養基中的酵母粉對溶磷菌溶解無機磷有限制作用，而MgCl2對溶磷菌溶磷非常重要[23]。同時有研究表明，去掉PKO培養基中的鐵、鎂、錳、鈉等無機鹽可顯著提高溶磷菌的溶磷能力[15]。有研究表明，溶磷菌對無機營養需要量很少，磷礦粉中的含量能夠滿足其需要，去掉培養基中鐵、錳、鎂、鈉等無機鹽能顯著提高細菌溶解磷礦粉的能力，并且培養基中缺少這些離子，能減少磷酸根與其反應形成難溶性化合物，從而避免了微生物釋放出來的磷被再固定[15]。本研究發現，葡萄糖、氯化鎂、硫酸銨添加量對PKOC2培養基的溶磷能力具有顯著影響，是該培養基的關鍵影響因子。溶磷過程是復雜的，并不是某一因素起全部作用，而是多種因素共同作用的結果，因此確定培養基最佳影響因子的最佳添加量對溶磷培養基的改良具有重要意義。通常優化培養基的方法主要有正交試驗和均勻試驗，這些試驗設計次數較少，獲得的優化結果不夠準確，而響應面法(RSM)可解決優化溶磷培養基組分的問題。Gao等[24]利用RSM中的CCD試驗完成了乳桿菌發酵培養基的優化，并使其制作成本降低了11%。Lotfy等[25]使用Box-Benhnken(Box)試驗設計優化了黑曲霉的培養基組成，優化后的培養基使菌株的檸檬酸產率提高了14倍以上。本研究對溶磷PKOC2培養基的組成采用響應曲面法進行優化，最佳培養基成分為(1.0 L)：葡萄糖18.19 g，Ca3(PO4)25 g，MgCl2·6H2O 3.21 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.08 g。從研究結果還可以發現，溶磷圈可以作為篩選溶磷菌株的必要條件，但不是充分條件，僅僅靠溶磷圈的大小來判斷溶磷菌株溶磷能力的大小不夠完善[26]。齊文娟等[16]研究發現，不添加酵母膏的PKO培養基更適用于分離篩選小麥和苜蓿根際的溶磷細菌，并且該培養基被改良之后，4種溶磷細菌分泌出的有機酸種類和含量都有明顯的增加。定量分析雖然可靠，但是對于大量溶磷菌株的初篩來講，定性分析也是必不可少的，通過定性分析菌株是否產生溶磷圈可以縮短篩選溶磷菌株的時間。植物根際土壤中存在多種溶磷微生物，不同溶磷微生物的溶磷途徑復雜多樣。近年來的研究資料表明，分泌有機酸是溶磷微生物溶磷的主要途徑之一。目前已經發現的溶磷微生物培養過程中分泌的有機酸種類主要有：乙酸、丙二酸、草酸、乳酸、丁酸、丙酸、葡萄糖酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等[15,27]。這幾類有機酸分泌到土壤中會使土壤酸度增加，有效促進土壤中難溶性磷酸鹽的轉化和吸收，進而促進作物生長。然而不同溶磷微生物分泌的有機酸種類和含量各不相同，其溶磷途徑也存在很大差異，因此有必要對上述分離篩選的溶磷菌株的溶磷機制進行進一步的研究。