穿山龍總皂苷對臭氧誘導的小鼠氣道高反應性和IL-17A表達的影響*

王愛利，王悅，郭佳，劉磊，李晶晶，鄧林紅△

(1.常州大學 生物醫學工程與健康科學研究院暨常州市呼吸醫學工程重點實驗室，常州 213164;2.常州大學 制藥與生命科學學院/護理學院，常州 213164)

1 引 言

氣道高反應性(airway hyperresponsiveness，AHR)是哮喘的重要病理生理學特征[1]。目前β2受體激動劑是降低AHR的最有效藥物，但停藥后常會引起AHR復發，且部分哮喘患者會產生抗藥性而使治療失效，故有必要尋求其它能有效緩解AHR的替代藥物。穿山龍總皂苷為植物穿山龍薯蕷根莖的提取物，已知其具有調節免疫、改善心血管功能、鎮咳、祛痰、平喘等多種藥理作用[2]。近期有研究報道穿山龍總皂苷可抑制哮喘模型動物的氣道炎癥反應[3]。例如，在哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、血清、痰液及肺組織中發現炎癥因子白介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)均升高，其水平與哮喘嚴重程度相關[4]；哮喘患者高表達的IL-17A可作用于上皮下的成纖維細胞和平滑肌細胞使之增殖，誘導氣道重塑，加重AHR[5]；而穿山龍總皂苷則能通過抑制IL-17A的作用抑制炎癥反應[6]。但目前對其是否可緩解AHR未見有研究。因此，本研究采用臭氧(ozone, O3)應激小鼠，以分別建立急性、亞急性AHR模型，進而觀察穿山龍總皂苷對小鼠AHR模型中氣道阻力的影響以及IL-17A的相關變化，初步探討穿山龍總皂苷通過降低IL-17A水平而抑制AHR的作用機制，為尋找治療AHR的中草藥提供新的思路。

2 材料和方法

2.1 試劑與動物

2.1.1實驗動物 選取SPF級雄性Balb/c小鼠30只，6～8周齡，體重20±2 g，由常州卡文斯動物有限公司提供，動物合格證號: No. SCXK-(JS)-2016-0010。

2.1.2實驗試劑及儀器 穿山龍總皂苷(南京普怡生物)；戊巴比妥鈉(德國Merck)；小鼠IL-17A ELISA試劑盒(武漢Proteintech)；蛋白定量試劑盒(上海BIO-RAD)；穿山龍總皂苷及醋酸潑尼松以含0.01% 吐溫80為溶媒的0.9% NaCl(生理鹽水)做溶劑當日配制。小動物肺功能檢測儀(加拿大SCIREQ)；臭氧發生器(北京力天)；酶標儀(美國TECAN)。

2.2 O3誘導急性、亞急性AHR小鼠模型

2.2.1急性AHR小鼠模型 小鼠隨機分成6組：正常對照組、O3應激組、穿山龍總皂苷治療組與醋酸潑尼松治療組，其中穿山龍總皂苷治療組分為高、中、低劑量3組，高、中、低劑量按小鼠體重計算分別對應為80、40、20 mg/kg，醋酸潑尼松治療組為陽性對照，劑量按小鼠體重計算為10 mg/kg。除正常組外，各組均接受臭氧應激。方法為將小鼠放置在透明塑料箱內，利用空氣泵產生空氣，臭氧發生器產生臭氧，臭氧與新鮮空氣在真空泵作用下混合，并通過插入透明塑料箱內的臭氧濃度監測儀實時監測箱內臭氧濃度，根據臭氧濃度監測儀顯示的臭氧濃度調節空氣流量閥門使箱內臭氧濃度維持在1.9～2.1 ppm范圍內，以下均標記為2 ppm[7]，急性AHR模型為臭氧應激組小鼠當天口鼻吸入2 ppm的臭氧一次性3 h。

2.2.2亞急性AHR小鼠模型 動物分組與實驗方法同上，但臭氧應激組小鼠每天上午定時口鼻吸入2 ppm 臭氧3 h，每隔1天1次，共3次。

2.2.3動物給藥 臭氧應激24 h后，治療組分別霧化吸入穿山龍總皂苷80、40、20 mg/kg劑量，陽性對照組霧化吸入醋酸潑尼松混懸液10 mg/kg，空白對照組霧化吸入生理鹽水[6]。各組均給藥30 min，霧化頻率為每隔半小時1次共3 次。所有實驗組均在末次激發后24 h，進行氣道阻力及氣道炎癥檢測。

2.3 小鼠氣道阻力檢測

小鼠用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)經腹腔注射、氣管切開后，連接FlexiVent小動物肺功能儀檢測氣道阻力(Rrs)，待呼吸平穩后，向霧化器內加入50 μL生理鹽水(基線)及1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg/mL濃度梯度的乙酰甲膽堿(Methacholine, Mch)，每個濃度測定3 min記錄12次Rrs峰值并取其平均值計算肺阻力[8]。

2.4 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)細胞總數及分類計數

通過留置針向小鼠肺內注入0.5 mL 4℃預冷的生理鹽水，重復此操作3次，回收率達到80 %，于12 000 g，4℃離心10 min，收集上清液存于-80℃備用。細胞沉淀用100 μL生理鹽水重懸，取10 μL計細胞總數，將剩余的細胞懸液涂片、行瑞氏-吉姆薩染色，在光鏡下計算細胞總數及分類計數。

2.5 BALF中IL-17A的檢測

用生理鹽水分3次通過插入的留置針灌入支氣管肺泡內，然后回收，離心，收集上清液用于檢測炎癥因子IL-17A的水平，操作步驟按照小鼠的IL-17A ELISA試劑盒說明書進行，采用酶標儀450 nm 波長下檢測OD 值。

2.6 肺組織勻漿液中總蛋白及IL-17A的檢測

小鼠被麻醉開胸取出肺組織，制備10%肺組織勻漿液。于12 000 g，4℃下離心20 min，上清液中總蛋白濃度用雙茴香寧酸(bicinchonininc acid,BCA)法蛋白濃度定量試劑盒測定，按ELISA試劑盒說明書測定IL-17A水平。根據組織勻漿總蛋白濃度計算出每100 mg肺組織炎癥因子濃度，炎癥因子濃度(pg/100 mg肺組織)=實測值(pg/mL)/肺組織重量×100 mg/總蛋白濃度(mg/mL)，炎癥因子的表達方法均為ELISA實測結果與100 mg肺組織勻漿總蛋白的比值[9]。

2.7 統計分析

實驗數據采用平均值±標準差(±SD)表示，用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析，兩組以上比較應用單因素方差分析，組間差異采用t檢驗，p<0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 臭氧誘導小鼠急性、亞急性AHR模型的建立及表征

3.1.1臭氧誘導AHR模型小鼠氣道阻力變化 由圖1可見，急性、亞急性模型臭氧組小鼠氣道阻力值均隨著Mch劑量的增加而呈現上升趨勢，當Mch刺激濃度增加到12.5 mg/mL后，與正常對照組相比，急性、亞急性臭氧組氣道阻力值均顯著性增加(**p<0.01)。

圖1臭氧誘導AHR模型隨乙酰甲膽堿刺激的變化(急性(A)、亞急性(B);n=5, **p<0.01; *p<0.05vs正常組)

Fig1Changeofairwayresistanceinozone-inducedAHRmodelmiceinresponsetomethacholine(Mch)stimulation(acute(A)、subacute(B) ;n=5, **p<0.01; *p<0.05vscontrol)

3.1.2臭氧誘導AHR模型小鼠BALF細胞總數及分類計數的變化 由圖2可見，臭氧組小鼠氣道炎癥較對照組明顯增加，正常小鼠BALF中主要表現為淋巴細胞和巨噬細胞增多，而中性粒細胞含量甚少，與對照組相比，急性、亞急性模型臭氧組小鼠BALF中細胞總數、巨噬細胞數及嗜中性粒細胞數均明顯升高(**p<0.01)，以上結果表明本研究成功建立了急性、亞急性AHR模型。

圖2臭氧誘導AHR模型小鼠肺泡灌洗液中細胞總數及分類計數(急性(A)、亞急性(B);Eos:嗜酸性細胞;Neu:中性粒細胞;Lym:淋巴細胞;Mac:巨噬細胞;n=5, **p<0.01; *p<0.05vs正常組)

Fig2MeannumbersoftotalcellsanddifferentialcellsrecoveredfromBALFinozone-inducedAHRmodelmice(acute(A)、subacute(B);Eos:Eosinophils;Neu:Neutrophils;Lym:Lymphocytes;Mac:Macrophages;n=5, **p<0.01; *p<0.05vscontrol)

3.2 穿山龍總皂苷對AHR模型小鼠氣道阻力的影響

圖3 A、B顯示穿山龍總皂苷對臭氧誘導的急性、亞急性AHR模型小鼠氣道阻力的影響結果，可見隨著Mch激發濃度的增加，各組氣道阻力值均逐漸增加，但與生理鹽水組相比，霧化吸入濃度梯度的穿山龍總皂苷藥物后氣道阻力值均有所降低，高濃度的穿山龍總皂苷降低氣道阻力的效果更加明顯。

圖3穿山龍總皂苷對臭氧誘導AHR模型小鼠氣道阻力的影響(急性(A)、亞急性(B);n=5, **p<0.01; *p<0.05vs生理鹽水)

Fig3EffectofCDNonairwayresistanceofozone-inducedAHRmodlemice.(acute(A)、subacute(B);n=5, **p<0.01; *p<0.05vs生理鹽水)

3.3 穿山龍總皂苷對AHR模型小鼠BALF中IL-17A的影響

圖4 A、B顯示穿山龍總皂苷對臭氧誘導的急性、亞急性AHR模型小鼠BALF中IL-17A的影響結果，可見生理鹽水組BALF中IL-17A水平較正常組明顯升高(**p<0.01)；霧化吸入梯度劑量的穿山龍總皂苷后，各藥物治療組IL-17A的水平較生理鹽水組(空白溶劑對照組)顯著降低，且藥物濃度越高穿山龍總皂苷降低IL-17A的水平越明顯。

3.4 穿山龍總皂苷對急性AHR模型小鼠肺組織勻漿液中IL-17A的影響

圖5顯示穿山龍總皂苷對臭氧誘導的急性AHR模型小鼠肺組織勻漿液中IL-17A的影響結果，可見生理鹽水組肺組織勻漿中IL-17A水平明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(**P<0.01)，各穿山龍總皂苷治療組與陰性對照組相比，IL-17A水平明顯降低，當霧化吸入80、40 mg/kg的穿山龍總皂苷時可顯著降低肺勻漿液中IL-17A的水平(**p<0.01)，其作用效果優于10 mg/kg醋酸潑尼松懸液。

圖4穿山龍總皂苷對臭氧誘導AHR模型小鼠肺泡灌洗液中IL-17A的影響

(急性(A)、亞急性(B);n=5, **p<0.01vs正常, **p<0.01vs生理鹽水)

Fig4EffectofCDNonIL-17AinBALFofozone-inducedAHRmodlemice.(acute(A)、subacute(B);n=5, **p<0.01vscontrol, **p<0.01vs生理鹽水)

圖5穿山龍總皂苷對臭氧誘導的AHR模型小鼠急性肺組織勻漿液中IL-17A的影響。(n=5,**p<0.01vs.正常, **p<0.01vs生理鹽水)

Fig5EffectofCDNonIL-17Ainlungtissuehomogenatesofozone-inducedacuteAHRmodlemice(n=5,**p<0.01vs.control, **p<0.01vssaline)

4 討論

哮喘發病率的持續上升提示環境因素可能起重要作用。臭氧是環境中的有害因素，可以改變肺結構和肺功能，導致哮喘癥狀，如氣道炎癥和氣道高反應[10]。臭氧誘導產生AHR模型小鼠的方式通常可分為急性、亞急性、及慢性三種[11]。由于慢性模型伴有肺炎，肺氣腫，氣道重塑等嚴重肺部病理變化，影響到對AHR的治療效果的評判[12]，而本研究旨在探究穿山龍總皂苷對AHR的治療作用，故選擇采用臭氧誘導小鼠建立急性[13]、亞急性AHR[14]模型。

研究證明急性、亞急性AHR模型中暴露于臭氧，可誘導嗜中性粒細胞氣道炎癥和氣道阻力增加[15]。我們的研究也證實了這一現象。實驗結果顯示，臭氧應激后急性、亞急性氣道阻力及嗜中性粒炎癥細胞數均呈劑量依賴性增加。表明臭氧組小鼠存在AHR及氣道炎癥病理變化。動物實驗表明穿山龍總皂苷對吸入卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導的小鼠呼吸道炎癥具有良好的治療效果，可抑制Th2炎癥反應、氣道重塑[3，16]。但穿山龍總皂苷對臭氧誘導的AHR的影響未見研究。本研究結果顯示，對急性模型而言，當Mch的劑量達到25 mg/mL濃度激發時，霧化吸入80、40 mg/kg的穿山龍總皂苷均能顯著降低氣道阻力，但對于亞急性模型而言，霧化吸入80 mg/kg的穿山龍總皂苷可降低小鼠氣道阻力；當Mch的劑量增加到100 mg/mL時，霧化吸入80、40、20 mg/kg劑量的穿山龍總皂苷均可降低兩模型組小鼠氣道阻力。因此，從本研究的結果看，不論對急性或亞急性AHR模型小鼠，霧化吸入梯度劑量的穿山龍總皂苷可不同程度降低Mch誘導的氣道阻力，且氣道阻力的降低程度呈劑量依賴性。這些結果從表象上證明，穿山龍總皂苷至少對臭氧誘導的急性、亞急性AHR模型小鼠具有有效緩解AHR的治療作用。

AHR的內在機制是由于炎癥介質導致氣道平滑肌產生急性收縮反應[17]。而由Th17 細胞分泌的IL-17A是一種具有多種功能的強效致炎因子，可促進組織炎癥發生，并參與AHR的發生[18]。文獻報道穿山龍總皂苷可通過抑制OVA誘導的哮喘小鼠體內IL-17A 的水平，發揮治療哮喘的作用[6]。但穿山龍總皂苷對臭氧誘導的AHR模型小鼠氣道阻力的降低是否也與體內IL-17A 的改變有關，尚未見報道。本研究的實驗結果顯示，無論在急性、亞急性AHR模型小鼠中，臭氧刺激都會導致IL-17A的顯著增高。但對急性AHR模型而言，霧化吸入80 mg/kg的穿山龍總皂苷即可顯著降低肺泡灌洗液中IL-17A水平。對亞急性AHR模型而言，霧化吸入80、40、20 mg/kg的穿山龍總皂苷均可有效降低肺泡灌洗液中IL-17A的水平。本研究還發現霧化吸入80、40 mg/kg的穿山龍總皂苷也可降低急性AHR模型小鼠肺組織勻漿中IL-17A的水平。這些結果與氣道阻力的變化趨勢一致。因此，在臭氧誘導AHR模型中，AHR的產生很可能與研究報道的OVA通過驅動IL-17A上調，從而增強氣道平滑肌收縮，進而誘導AHR[19]的機制一致。同時也說明穿山龍總皂苷很可能是通過抑制小鼠體內IL-17A水平，而降低臭氧誘導AHR模型小鼠的氣道阻力，進而達到緩解其AHR的作用。

綜上所述，霧化吸入穿山龍總皂苷(80、40、20 mg/kg)可不同程度降低急性、亞急性AHR，此作用可能與穿山龍總皂苷能夠降低IL-17A的水平相關，從而為穿山龍總皂苷緩解或治療AHR癥狀提供實驗依據。