雌激素對缺血性腦卒中的保護作用及相關機制研究進展

任北大，程發峰，王雪茜，劉姝伶，穆 杰，紀雯婷，郝高庭，王慶國※

(1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029; 2.山西中醫學院附屬醫院急診科，太原 030024)

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是影響人類健康和生命的重要疾病之一。研究顯示，我國腦卒中亞型中近70%是CIS[1]。CIS的年復發率高達17.7%[2]，具有高發病率、高致殘率和高病死率的特點[3]。腦卒中發展狀況不能有效緩解，將給全球，尤其是中國帶來巨大社會壓力和沉重經濟負擔[4-5]。雌激素屬于甾體類固醇激素，自1923年發現以來，已證明對多種神經系統疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病、腦缺血、精神分裂癥等)有良好的治療效果[6-7]。流行病學研究表明，女性絕經前CIS的發病率顯著低于同年齡男性，絕經后罹患CIS的風險與男性相當，但預后較差[8-10]，可能是由于絕經后女性體內雌激素水平下降導致神經保護作用缺失，導致腦卒中發病率也隨之升高[11-12]。雌激素受體(estrogen receptor, ER)主要包括經典核受體和膜受體及分別介導雌激素的基因效應和快速非基因效應，參與調節機體的生殖、記憶、學習、認知等功能[13]。以上提示，研究CIS時不應忽視雌激素及ER水平變化對疾病的影響?，F以雌激素為切入點，探討雌激素、ER對CIS的保護作用及相關機制。

1 雌激素與ER

雌激素主要由卵巢和胎盤產生，少量由肝、腎上腺皮質、睪丸產生，中樞神經系統(central nervous system，CNS)亦能合成雌激素。雌激素主要由雌二醇、雌酮及其代謝產物雌三醇組成，其中雌二醇含量最高、作用最強，雌三醇和雌酮含量較低、作用較小。雌激素作用廣泛，除作用于生殖系統外，還可影響神經系統、胃腸道、肝臟、骨骼及心血管的活動[14]。

ER主要存在于靶器官細胞的細胞膜、細胞質或細胞核，可與雌激素特異性結合，形成激素-受體復合物，從而引發基因調控機制，影響下游基因的轉錄，進而對CIS發揮保護作用。

ER有經典核受體和膜性受體兩種。經典核受體包括ERα和ERβ兩種亞型，ERα主要分布在下丘腦、海馬及視交叉前區，皮質分布相對較少，與神經系統和內分泌系統活動相關；ERβ主要分布在嗅球、基底前腦、大腦皮質、海馬、小腦、黑質等部位，與學習記憶、運動調控相關。ERα和ERβ在海馬和皮質區的分布有部分重疊，均通過基因調節效應起作用。雌二醇可直接或間接與ER，特別是ERα結合，調節基因的表達，發揮對缺血區的保護作用。膜性受體包括經典核受體的膜性成分、GPR30、Gaq-ER及ER-X等，通過快速非基因型效應起作用。Pietras和Szego[15]推測，在子宮內膜的上皮細胞和肝臟細胞上存在胞膜性ER；Pappas等[16]首次證實細胞膜上存在ERα；Filardo等[17]發現，雌激素激活細胞外信號調節激酶1/2需要GPR30的表達；Revankar等[18]發現，雌激素是GPR30的配體。Gaq-ER是一種調節氨基丁酸B受體去敏感化的ER。ER-X與ERα具有相同的C區，是一種未知的新型基因。膜受體和核受體可相互影響，共同調節神經元。

2 雌激素/ER與CIS的關系

急慢性腦缺血是導致CIS發病的核心原因，腦血流不足引起氧自由基毒性增高、興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)毒性、炎癥反應等，導致神經元凋亡、壞死，造成CIS的高致殘率和高死亡率。雌激素和ER與CNS關系密切。雌激素具有脂溶性，可通過血腦屏障進入CNS。腦損傷時，局部反應性星形膠質細胞在芳香化酶的作用下可以合成雌激素，從而調節突觸重建，增加腦血流量，進而促進神經再生。以上說明雌激素在一定程度上，通過一定的方式，發揮調節CNS功能的作用。這些也證實雌激素對于CIS確有療效，提示雌激素在腦部疾病中的應用價值。

根據ER的生理特性及在腦缺血疾病中發揮的基礎性調節作用，ER調節物的作用機制和對腦缺血疾病的治療效果成為當前研究熱點。

3 雌激素和ER對CIS的作用

3.1雌激素的大腦保護作用 通過對CNKI(124篇)、PubMed(183篇)，共307篇文獻的整理分析發現，雌激素對CIS發揮神經保護作用主要通過拮抗EAA毒性、抗氧化應激、擴張血管、增加腦部血流量、改善神經元胞突結合的緊密型、抑制β淀粉樣變性、調節細胞內Ca2+水平、增強營養機制、促進多種神經遞質合成、抗凋亡、抑制動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)、抑制內皮細胞凋亡、抑制炎性因子表達、抗自由基損傷、調節內皮源性一氧化氮水平、增加葡萄糖載體蛋白的表達、促進神經生長因子表達、改善認知和記憶功能、促進細胞骨架和細胞因子恢復、保護膠質細胞、提高腦內能量代謝水平、促進新生血管生長。這些作用基本涵蓋了雌激素發揮腦保護作用的全部方面。按CIS的發病特點以及雌激素所起的保護作用，可以將雌激素對CIS的作用整合為以下8個主要方面(圖1)。

3.1.1EAA毒性作用 EAA是CNS的主要興奮性神經遞質，當大腦缺血時，腦內釋放大量EAA，過度激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體，引起細胞膜、線粒體膜、內質網膜等部位的鈣通道性狀改變和Ca2+泵活性下降，Ca2+經L型電壓門控通道和激動劑型門控通道內流，出現通透性轉化，同時細胞器貯存的Ca2+進一步釋放，最終導致細胞內Ca2+超載，而Ca2+超載是缺血性腦損害的關鍵環節，同時也是不同類型細胞發生凋亡的關鍵因素和共同觸發機制。這一機制在整個神經細胞死亡過程中起著基礎性的先導作用。Weaver和Legette[19]研究發現，17β-雌二醇可直接抑制NMDA受體及其誘導的動作電位，進而減弱由NMDA介導的神經毒性作用，最終明顯降低細胞內Ca2+水平，從而阻斷后續級聯反應的發生。

3.1.2氧化應激通路 氧化應激誘導的神經細胞死亡是CIS造成神經損害的關鍵因素之一。腦缺血后產生的β淀粉樣蛋白、谷氨酸、Fe2+可引起氧化應激反應。此外，氧自由基學說在腦缺血/再灌注所致的損傷中也發揮著較為重要的作用[20]。腦缺血/再灌注發生時，腦細胞產生過量的氧自由基，并易于與脂類、蛋白質以及核酸發生脂質過氧化反應，進而造成神經細胞、膠質細胞及血管內皮細胞損傷[21-22]。研究表明，提高內源性自由基清除劑的含量可以抑制CIS后神經細胞的凋亡[23]。在慢性腦缺血損傷中，產生的過量的一氧化氮自由基具有細胞毒性作用，而誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是一氧化氮合成的主要限速酶，被認為iNOS是一種“病理型”酶[24]。雌激素可以抑制白細胞介素(interleukin，IL)1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α等炎性因子的釋放[25]，這些炎性因子能誘導小膠質細胞、巨噬細胞表達iNOS[26]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是iNOS的上游因子，雌激素可通過阻止NF-κB的激活抑制iNOS的活化。另外，腦缺血發生時所產生的自由基主要是丙二醛，其含量的高低直接反映了脂質過氧化的水平，間接反映了細胞損傷的程度。同時，超氧化物歧化酶是主要的抗氧化酶之一，能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，阻斷自由基一氧化氮及其產生的高毒性氧化劑，從而減輕腦組織損傷。

COX-2：環加氧酶2；IL-1β：白細胞介素1β；TNF-α：腫瘤壞死因子α；NF-κB：核因子κB；EAA：興奮性氨基酸；NMDA：N-甲基-D-天冬氨酸；CaMKⅣ:鈣調蛋白激酶2；SIK2：鹽誘導激酶2；Calcineurin:鈣調磷酸酶；TORC1：雷帕霉素受體復合物；CREB：環腺苷酸效應元件結合蛋白；GSK-3β：糖原合成酶激酶3β；Akt：蛋白激酶B；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶；Mcl-1磷酸化：髓性白血病細胞1；NOS：一氧化氮合酶

3.1.3炎癥反應通路 白細胞浸潤和細胞因子的釋放在CIS后炎癥反應的發生和發展中發揮著關鍵作用。白細胞浸潤是炎癥反應的特征之一。IL-1β和TNF-α是觸發炎癥反應最為重要的兩種細胞因子，兩者可與效應細胞上的受體結合，促使炎癥升級。IL-1β具有多重促炎、促凝及調節細胞生長的作用[27]，可被包括內皮細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞以及神經元在內的多種細胞合成[28]。Cheng等[29]發現，在CIS損害過程中雌激素的干預可以有效抑制巨噬細胞的滲出以及IL-1β和TNF-α等細胞因子的釋放。

目前認為，雌激素的抗炎作用可能與抑制NF-κB的活化有關[30]。在大部分細胞中，NF-κB二聚體與細胞質中的抑制蛋白結合形成三聚體復合物，并以無活性的形式存在于胞質中。當腦缺血發生時，腦血管內皮細胞、神經元以及膠質細胞中的NF-κB被激活并快速進入核內，與核內DNA上的特異序列結合，從而促使黏附分子、細胞因子等表達，致使炎癥發生。因此，NF-κB被認為是血管內皮細胞、神經元以及膠質細胞損傷的始動因素之一。雌激素抑制NF-κB活化的途徑主要有兩種：①雌激素具有明顯的抗氧化活性，通過清除自由基，降低腦缺血時谷氨酸水平，減少NMDA受體的過度激活，阻止鈣離子內流等抑制NF-κB活化[31];②NF-κB與ER相互拮抗，雌激素可通過上調受體抑制NF-κB的活化[32]。

3.1.4增加腦部血流量 雌激素主要通過以下兩個方面增加缺血時腦部血流量：①雌激素與其受體相作用，促進腦血管內皮細胞增生和新血管形成,這種作用可以被ER拮抗劑ICI182780所阻斷[33]；②擴張腦部血管，雌激素作為血管擴張因子能增加腦缺血區域的血流量，從而減輕腦缺血造成的損傷[34]。雌激素增加腦缺血區域血流量與以下因素有關：①通過抑制平滑肌收縮和內皮細胞釋放內皮素，增加腦部血流量，減輕腦損傷。②通過阻斷和激活細胞上的離子通道，從而保持細胞內外離子的平衡，進而維持平滑肌正常的舒張功能[35]。③可減輕腦微小血管結構損害，降低血管通透性，改善腦微循環。④調節膽固醇代謝和沉積，減少動脈粥樣斑塊形成。⑤雌激素的血管保護作用是由血管壁的ER介導的，如雌激素通過受體介導途徑抑制IL-1β轉換酶信使RNA的表達以及TNF-α介導的內皮細胞凋亡，從而保持內皮細胞的完整性和功能，減輕腦組織缺血損傷[36]。⑥雌激素神經保護作用與一氧化氮相關，通過增強內皮型一氧化氮合酶的活性，可以增加腦血流量[37]。

3.1.5凋亡通路 神經元的死亡包括壞死和凋亡兩種方式。壞死發展迅速，不可逆，腦缺血發生時較難控制；凋亡強調自然的生理學過程，其發生受多種機制調控，因此調節凋亡過程中的關鍵因素可有效防止神經元凋亡[38]。Bcl-2基因是目前發現的最重要的凋亡抑制基因，是一種與線粒體膜相關聯的穩定蛋白，一般位于核膜、內質網以及線粒體膜上。CIS發生后，Bcl-2在腦內表達增高，能減少海馬組織神經細胞凋亡的數量。Bax蛋白是由Bcl-2的同源基因Bax編碼，具有促進細胞凋亡的作用，與Bcl-2相互拮抗，并可使Bcl-2失活。因此，Bax蛋白的表達量直接影響凋亡信號刺激后細胞存活或凋亡的比率，是決定細胞凋亡嚴重程度的關鍵基因[39-40]。

Bcl-2/Bax主要通過以下4個途徑抑制細胞凋亡[41]：①Bcl-2拮抗促凋亡基因Bax，減少細胞色素C自線粒體的釋放，抑制細胞色素C對胱天蛋白酶(caspase)的激活；②Bcl-2促進谷胱甘肽進入細胞核，改變核內的氧化還原反應，抑制caspase的活動，減緩細胞凋亡；③通過抗氧化作用，清除氧自由基，抑制細胞凋亡；④Bcl-2/Bax蛋白的磷酸化/去磷酸化可能也與凋亡有一定關聯[42]。上述機制最終發生的關鍵環節是caspase家族成員所介導的蛋白酶級聯反應，其中caspase-3是腦缺血后神經細胞凋亡最關鍵的凋亡執行蛋白酶。腦缺血發生時，位于缺血梗死灶邊緣的caspase-3被多種刺激信號激活，促使細胞內重要的蛋白質降解失活，從而誘導神經元凋亡[43]。

研究發現，雌激素具有調節轉錄的作用，能明顯增加海馬神經元抗凋亡基因Bcl-2的表達，說明在Bcl-2基因中存在雌激素應答元件，且在一定范圍內雌激素水平與大鼠腦缺血后Bcl-2蛋白的表達呈正相關[41,44]，提示在今后的研究和臨床診治中應該考慮雌激素血藥濃度的問題。此外，雌激素還能明顯降低缺血梗死灶邊緣caspase-3的陽性表達[45]。另外，腦皮質ER-β的增加與Bcl-2上調一致[46]，推斷雌激素與腦皮質ER-β的結合使Bcl-2的表達上調，從而發揮腦保護作用。

3.1.6對As的作用 As是導致CIS的病理基礎之一。雌激素通過調節低密度脂蛋白而對As的發展起抑制作用。臨床實踐發現，絕經后女性血清高密度脂蛋白的水平逐漸降低，而血清總膽固醇、低密度脂蛋白及三酰甘油的水平逐漸升高。此時，因雌激素水平降低，低密度脂蛋白的降解受到抑制，導致運送到動脈壁的膽固醇增多，而高密度脂蛋白的生成減少，使高密度脂蛋白清除動脈壁上沉積的膽固醇的能力降低，最終導致As。因此，可以考慮從雌激素治療As入手預防CIS的發生。

3.1.7改善認知功能 認知功能形成的基礎是突觸，而突觸囊泡上的蛋白質-突觸素是形成突觸的關鍵物質，突觸素具有在神經元之間傳遞信息的作用。研究發現，雌激素缺乏則神經元營養不足，突觸素活性下降，突觸囊泡轉運能力下降，膽堿能神經遞質活性下降，神經元代謝及蛋白質合成能力下降，海馬、海馬旁回、顳葉以及額葉神經元活動下降，最終導致學習記憶能力下降[47]。Murphy等[48]研究發現，雌激素可明顯增加誘導培養的海馬細胞樹突棘的數量，增加突觸的連接部位，在人類和動物的學習記憶中起重要作用。研究表明，預先使用、抑或在腦缺血發生時合理使用雌激素及其受體激動劑[49]，并合理控制給藥時間、劑量、途徑[50]能降低CIS發生后梗死面積、改善認知記憶功能、加快卒中后的恢復[51]。

3.1.8雌激素對膠質細胞的作用 膠質細胞廣泛存在于CNS中，主要包括星形膠質細胞、小膠質細胞及少突膠質細胞，通過支持和引導神經元活動，參與神經系統的修復。對于星形膠質細胞，雌激素的作用如下：①通過調節星形膠質細胞源性神經轉移生長因子、胰島素樣生長因子1、膠質纖維酸性蛋白以及載脂蛋白E發揮腦保護作用；②通過改變腦損傷后星形膠質細胞的生理、生化特點發揮腦保護作用；③通過影響星形膠質細胞對神經免疫反應的調節來發揮腦保護作用；④腦損傷時星形膠質細胞可合成芳香化酶，從而促進內源性雌激素的合成[52]。

小膠質細胞對缺血的敏感性較高，當腦缺血發生時，雌激素可通過增加蛋白酶的合成，減少小膠質細胞釋放氧自由基和炎性細胞因子，達到保護神經的目的[53]。小膠質細胞在CNS炎癥反應和免疫應答中起關鍵作用。

少突膠質細胞在CNS中主要是協助神經電信號的高效傳遞，維持和保護神經元的正常功能。Lu等[54]研究發現，雌激素參與少突細胞中血紅素加氧酶氧基1和星形膠質細胞中熱激蛋白25/27的合成，并有一定的神經保護作用。

3.2ER發揮腦保護作用的機制 ER主要通過兩方面發揮腦保護作用。①基因調控：主要通過調控特異性靶點基因的轉錄合成特殊蛋白，從而發揮腦保護作用。具體是雌激素與經典核受體結合形成激素受體復合物，進而與DNA上特殊的激素反應位點相作用，從而發揮生理功能。目前文獻中提到的ER調節物有三苯氧胺、金雀異黃素等，但發揮作用的機制尚不清楚[55]。②非基因調控機制：主要是指雌激素與膜性受體結合發揮作用，具體機制尚不清楚，可能是雌激素與膜受體結合后胞內環腺苷酸增加，提高了蛋白激酶A的活性，促使Ca2+通道磷酸化，導致Ca2+內流，提高了細胞內Ca2+水平，從而發揮生物學作用。與基因調控機制相比，非基因調控機制存在4點不同：不涉及基因表達、不涉及特殊蛋白的合成、不能被信使RNA轉錄和蛋白質合成的抑制劑所阻斷、不受經典核受體拮抗劑影響。

關于ER是否在CIS中發揮信號通路的作用，目前仍有爭議。主要爭議為ER是否參與了雌激素發揮神經保護作用的機制。通過總結分析近年來關于雌激素和ER的文獻發現，雌激素對CIS的神經保護作用概括為[56]：①雌激素單獨起作用，即使在ER拮抗劑存在的前提下，亦能有效減少缺血區及半暗帶神經細胞的凋亡，證明了雌激素發揮作用存在非受體介導、非轉錄機制；②雌激素通過與核受體結合發揮基因調控作用；③雌激素與膜性受體結合發揮非基因調控作用。以上明確說明ER在CIS的神經保護機制中發揮著十分重要的作用，但是同樣也說明了并非只是或只有ER發揮了作用，這是因為CIS的神經保護作用機制具有其特殊的復雜性，研究中應當辨證看待。

4 小 結

關于雌激素對CIS的腦保護作用、作用機制以及臨床應用目前國內外研究的已較為深入，但在起作用的關鍵通路、藥理毒理、藥物間藥效的影響、臨床如何合理使用以及替代治療方面，仍存在不完善之處。主要問題總結如下：①體內雌激素和雄激素可由同一組織產生，某種程度上兩者亦可相互轉化，因此在基礎實驗和臨床試驗中，應當對這兩種激素間是否存在促進或拮抗作用予以重視。②雌激素和ER在降低腦缺血的發病率、致殘率以及病死率方面的作用已被證實，但臨床難以將酗酒、吸煙、情緒等受主觀影響較大的因素納入評價體系，故存在一定的片面性。③關于雌激素相關藥物的使用。CIS發生后神經元的死亡涉及不同的通路，因而藥物阻滯劑就存在不同的選擇，這就涉及藥物間協同起效和不良反應的問題。因此，針對作用機制進行有目的的藥物研發具有廣闊的市場前景。有研究提示，積極控制血壓[57]、血脂[3]、血糖[58-59]，改善不健康的生活方式[60]、睡眠和運動，治療睡眠呼吸暫停[61]等可預防CIS的發生。此外，避孕藥、遺傳性腦病同樣也是CIS的危險因素[3]。使用藥物時應予以考慮。④關于雌激素替代治療CIS的相關問題。目前以植物性雌激素為代表的替代治療較多，其優勢主要在于降低長期服用雌激素產生的不良反應，而且安全、便宜[62]。植物性雌激素的主要成分富含于一些植物中藥中[63-67]。但也有研究提示，老年(平均63歲)患者應用雌激素替代治療反而加重腦卒中損傷和認知功能障礙[68]。此外，雌激素替代治療對人的生殖發育和女性月經周期也有不良影響。⑤因涉及CIS的作用機制較為復雜，因此應當明確不同機制間相互交叉起作用的關鍵點，對CIS的發生有一個全面的預判和把握。⑥關于雌激素和ER治療CIS的基礎研究和臨床研究在藥物有效性評價方面還存在一定的差異，究其原因可能是因為兩者對CIS所發生的階段和對治療結果的預判存在差異，應當加以考慮。