肝切除術后肝臟再生臨床應用研究進展

歐陽高雄，肖燕燕，任 遠，劉劍勇，張志明※

(1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科，南寧 530021； 2.陽新縣第三人民醫院超聲科，湖北 陽新 435200)

肝臟具有極強的代謝功能和再生潛能。當肝臟受到外傷、感染、中毒、肝切除等刺激后，肝細胞會迅速有序地分裂，顯示出超強的再生能力和強大的代償功能。在世界范圍內，肝細胞性肝癌(hepacellular carcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，而我國屬于HCC高發區，發病人數占全球HCC發生總數的70%，居國內腫瘤病死率的第3位[1-2]。目前，肝切除仍是HCC的主要治療方法之一[3-4]，而術后發生肝功能不全乃至肝衰竭是HCC患者在圍術期死亡的主要原因[5]。這可能是由于術后殘余肝體積不足，不能滿足機體代謝及肝臟再生的需求，故易發生肝功能不全、肝衰竭，甚至死亡[6]。因此，揭示肝切除術后肝臟再生的機制非常重要。現就肝切除術后肝臟再生的機制進行綜述，旨在深刻了解肝臟再生機制的基礎上更好、更安全地在臨床上開展肝臟大部分切除術及活體肝移植(living donor live transplantion，LDLT)，為各種肝臟疾病的診療提供新的策略。

1 肝切除后肝臟再生的過程

1.1肝再生的啟動階段 為方便研究和理解，學者們將肝再生劃分為啟動、增殖及終止階段。肝切除術后0～4 h即肝再生的啟動階段，此時肝實質細胞從G0期進入G1期。在此期內，轉錄因子基因、應激和炎癥反應相關基因、調節細胞骨架和細胞外基質基因、細胞周期調控基因等早期基因表達；肝切除術后4～12 h即肝再生啟動階段的進展期，細胞內多種延遲早期基因表達上調和部分細胞周期基因開始出現表達。

肝切除術后肝再生的啟動機制目前尚不清楚。分子生物學研究表明，肝切除術后炎癥和免疫反應促進肝實質細胞(肝細胞、血管內皮細胞、肝竇內皮細胞等)和肝內非實質細胞分泌多種活性物質，如白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等，這些活性物質通過血液循環作用于全身，共同觸發了殘余肝的再生[7]。生理學研究認為，肝切除術后殘余肝門靜脈壓力突然升高是肝再生最直接的啟動機制[8]。術后殘余肝門靜脈壓力急劇升高，導致肝竇內壓力迅速上升，刺激肝竇內皮細胞分泌HGF、IL-6、一氧化氮、一氧化氮合酶等因子，促進肝再生；急劇升高的門靜脈壓力對肝竇內皮細胞形成剪切應力，刺激肝竇內皮細胞和肝細胞增殖[9-10]。研究表明，在肝切除術后肝再生的啟動階段中，TNF-α和IL-6是促進肝細胞周期從G0向G1期轉變的主要細胞因子[11]。

TNF-α對肝再生具有雙重作用，在肝再生過程中充當肝再生的啟動因子，促進肝再生；當TNF-α水平過高時可以抑制和延緩肝再生[12]。TNF-α與受體結合后，能快速促進肝非實質性細胞(主要是庫普弗細胞)分泌和釋放IL-6和活化信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)，啟動肝再生[12]。研究表明，用TNF抗體處理的大鼠或剔除TNF受體1基因的小鼠，肝切除術后殘余肝細胞的增殖明顯下降，細胞內DNA的合成也明顯減少[13-14]。

IL-6是一種急性反應性蛋白，在肝切除后1 h迅速升高，24 h達到峰值。肝切除術后IL-6與其受體結合，使Janus激酶(Janus kinase，JAK)活化，激活轉錄因子STAT3，形成具有二聚體結構的STAT3，并轉移到細胞核內促進目的基因轉錄[15]。此外，IL-6通過調節細胞因子信號轉導抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)負反饋調節活化信號，即活化的STAT3過高時能促進SOCS的產生，從而抑制IL-6對STAT3的激活。SOCS在肝再生過程中發揮著重要的調節作用，通過與IL-6相互作用精確調節肝再生[16]。

1.2肝臟再生的增殖階段 增殖階段是指肝細胞在多種因子，如HGF、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)α、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等作用下進入G1期并向S期轉變的過程，主要涉及細胞的增殖和生長。肝再生的啟動階段和增殖階段并無明確的分界線，在啟動階段發揮作用的細胞活性物質和因子仍會作用于細胞周期的增殖階段。

細胞周期蛋白D1的產生標志著細胞進入細胞周期，是增殖階段重要的調控位點。啟動階段中被激活的STAT3調控多種基因，如細胞周期蛋白D1、p21等的表達，從而調節細胞周期[17]。與此同時產生的抗氧化蛋白和抗凋亡蛋白能抑制細胞的凋亡過程，進而保護肝細胞。此外,細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDKs)與周期蛋白結合形成CDKs復合物，抑制細胞周期相關調節蛋白，如Rb、p130的磷酸化，激活并釋放轉錄因子E2F，直接啟動和維持細胞周期的有序進行，促使肝細胞順利通過G1限制點，促進DNA復制和肝細胞增殖。當肝細胞通過G1限制點并出現細胞周期蛋白D1表達時，將不可逆地進行細胞周期循環，直到肝再生終止信號表達。

肝切除術后肝細胞從肝再生的啟動階段進入細胞周期的必備條件之一是HGF-cMet信號通路的激活。肝切除術后3 h，HGF即被合成，并以旁分泌或自分泌的形式作用于肝細胞，在肝細胞內通過信號級聯放大效應促進HGF的合成。c-Met是一種酪氨酸激酶受體，與HGF結合后迅速發生磷酸化。磷酸化的c-Met通過級聯作用使多種底物的酪氨酸發生磷酸化,進一步調控與細胞分裂周期密切相關的激酶，如細胞外信號調節激酶、蛋白激酶B、磷脂酰肌醇-3-激酶、S6等[18]。此外，c-Met還通過與凋亡受體Fas結合，發揮抗細胞凋亡效應，進而防止細胞凋亡[19]。

EGF與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)組成了一個極為復雜的分子信號轉導系統，在調控肝再生的分子信號轉導中發揮著無可替代的作用。此外，EGFR還存在另外的配體TGF-α，由肝細胞產生，也是肝再生的直接絲裂原，能促進肝細胞的分裂和增殖[20]。據文獻報道，肝切除術后小鼠血液中EGF的水平并未升高，而EGFR在術后30～60 min發生磷酸化[21]，其磷酸化增強的時間與c-Met激活的時間大致相同,可能的原因是EGFR與不同受體發生了交叉反應[22]。EGF在肝切除術后能強烈促進肝細胞的有絲分裂和增殖，為肝細胞提供極強的促有絲分裂信號[23-24]。

肝切除術后2～3 h，TGF-α即開始升高,并維持到術后48 h。TGF-α激活主要受TNF-α轉換酶調控蛋白質裂解物的調控[25]。研究表明，小鼠TGF-α基因過表達會導致肝臟過度增生，甚至癌變[26]。將TGF-α注入正常大鼠體內也會引起肝細胞增殖和DNA合成[27]。由此可見，TGF-α在肝臟的再生中扮演著至關重要的角色。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，能夠有效促進內皮細胞增殖、強烈促進血管再生、快速增加血管通透性，是肝再生過程中不可缺少的細胞因子[28]。研究表明，肝切除術后增殖的部分肝細胞可大量分泌VEGF，從而促進肝血竇內皮細胞的分裂和增殖，并調節肝竇血管網重建[29]。肝竇血管網重建是肝再生過程中的重要部分，其承擔著肝細胞的血液供應，同時在調節肝臟結構重構中發揮重要作用。

1.3肝臟再生的終止階段 研究表明，肝切除術后，殘余肝再生至術前或略超過術前肝重和體積時，肝細胞就會停止增殖和再生，并清除過量的肝細胞，以形成最佳的肝重和體積[30]。目前對于肝再生的終止信號尚不完全了解，TGF-β1是國內外學者研究最多的肝再生抑制信號分子，肝切除后早期增殖階段分泌的HGF和EGF除能促進肝細胞增殖外，也能激活TGF-β1。TGF-β1通過與TGF-β受體2結合使自身磷酸化，從而活化絲氨酸激酶，使下游靶分子Smad家族蛋白發生磷酸化，對抗其他生長因子的促增殖效應和促凋亡效應，抑制肝再生信號的轉導，激活肝再生的終止信號[31]。此外,TGF-β1還能活化肝星狀細胞，使其分泌細胞外基質，HGF與細胞外基質結合后能避免被尿激酶激活,從而抑制肝細胞的過度增殖,使HGF重新進入G0期[32]。

微RNA(microRNA，miRNA) 是一類新發現的小RNA，由調控基因轉錄后產生，參與生命體生長和發育的多個環節。miR-23b是具有多種信號通路調節功能的miRNA。用芯片篩選肝再生終止階段miRNA的表達時發現，miR-23b的表達量明顯降低[33]。隨后的動物實驗也發現，miR-23b的表達量在終止階段下調[34]。TGF-β1是miR-23b的上游調節分子，終止階段miR-23b表達的下調，導致Smad3的轉錄下降，從而間接激活TGF-β1信號通路，觸發肝再生的終止[35]。此外，肝臟再生過程中產生的神經生長因子通過與神經營養因子受體p75結合，使肝星狀細胞發生程序性凋亡,進而引發肝再生的終止[36]。還有研究認為,細胞外基質可以與整合素調節蛋白結合，從而引起肝再生終止[37]。肝再生的終止機制極為復雜，還有待于學者們進一步深入研究。

2 肝臟再生的臨床應用

隨著外科技術和患者管理水平的不斷提升，肝切除術后患者肝衰竭乃至死亡的發生率明顯減少，但術后肝功能不全仍時有發生。快速有效地促進肝再生，使殘余肝在短期內補充丟失的肝組織，滿足機體正常的代謝需求，防止術后肝功能不全的發生，有利于創傷的快速愈合和患者的早期康復。

2.1門靜脈栓塞術(portal vein embolization，PVE) PVE是指對門靜脈主要分支進行選擇性栓塞，從而改變門靜脈的血流狀況，使栓塞側肝葉的門靜脈血流供應明顯減少，而非栓塞側肝葉門靜脈和門靜脈壓血流供應增加，致使栓塞側肝葉壞死萎縮，非栓塞側肝葉代償增生[38-39]。在20世紀80年代，Kinoshita等[40]首次采用PVE治療原發性肝癌伴門靜脈癌栓患者發現，非栓塞側肝葉出現了明顯的增生。隨后一系列研究表明，行大部分肝切除術的患者術前應用PVE能夠促進預保留側肝葉的再生[41-43]。近年來PVE逐漸應用于臨床實踐中，目前肝切除術前PVE能快速促進預保留側肝葉再生，擴大手術切除指征，增加手術安全性，減少術后并發癥的發生。PVE僅用于有高風險肝切除術后，預計殘余肝組織不足的患者，并不具有普遍適用性[44]。對于PVE的適應證目前尚無統一標準，大部分學者認為，肝功能正常，殘余肝/總肝體積<25%或有基礎性肝病(殘余肝/總肝體積<40%)的患者直接行肝切除存在巨大的手術風險，由于殘余肝不足，無法滿足肝再生需求，易出現術后肝功能不全和術后并發癥，術前需要考慮PVE[45-46]。此外，對于肝功能正常(殘余肝/總肝體積>30%)或有肝硬化(殘余肝/總肝體積>50%)的患者直接行肝切除較為安全[47]。

2.2聯合肝臟分隔和門靜脈結扎的分階段肝切除術(associating liver partition with portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS) ALPPS包括兩個階段：第一階段，剖腹探查肝臟腫瘤，沿肝鐮狀韌帶離斷肝臟，并行右門靜脈結扎和膽囊切除，同時保留右肝動脈和靜脈；第二階段，術后1周殘余肝再生理想的情況下行擴大右半肝切除。ALPPS能促進殘余肝組織急速增生，從而提高手術的可切除率。ALPPS第一階段術后殘余肝組織1周內再生率高達74%～87%，遠優于門靜脈栓塞和結扎[48]。2012年，Schnitzbauer等[49]在研究中首次描述了該種手術方式。隨后多項研究證實，ALPPS給予PVE術后失敗以及肝切除術導致殘余肝體積不足的患者治療機會，提高了手術切除率[50-51]。

2.3LDLT 目前LDLT是治療終末期肝病唯一有效的方法。雖然LDLT有效解決了供肝短缺的問題，也為更多患者提供了手術機會，但移植后并發癥的發生率較高，這可能與移植肝體積不足有關。然而，為了保證活體供肝者的安全，往往需要盡量縮小移植肝的體積。因此，只有保持兩者之間的平衡，才能保證供體的安全，并改善受體的臨床預后。目前認為，移植肝與受體肝重量比>0.8%或移植肝與受體肝體積比>40%的情況下，移植肝才能夠維持術后受體基礎肝功能和肝再生[52]。

2.4手術切緣 由于術者習慣不同，手術切緣的處理也不同，而術中切緣的處理往往會影響術后殘余肝的再生。潘樹波和耿小平[53]行右半肝切除時發現，術中切除肝中靜脈Ⅳb段屬支，術后Ⅳb段肝再生往往不理想。Lubezky等[54]也發現，在右半肝切除患者中，保留肝中靜脈的患者術后S4段呈明顯不均勻性增生，而切除肝中靜脈的患者術后S4段呈均勻性增生，但后者S4段的再生率明顯低于前者。目前肝切除術中切緣的處理影響術后殘余肝再生的機制尚不十分清楚，可能與術后切緣的炎癥反應和靜脈引流有關。

2.5營養 營養不良或障礙必然會影響肝臟的再生，因此只有保證充足的營養攝入才能更好地促進肝臟的再生。部分肝切除術后給予患者輸入中長鏈脂肪乳和支鏈氨基酸能夠有效促進殘余肝組織的再生和肝功能的恢復。部分肝切除術后肝硬化患者殘余肝的肝細胞中存在明顯的能量代謝失衡，致使ATP合成顯著減少，導致殘余肝細胞的分裂和增殖明顯受到抑制，從而延緩患者術后肝功能的恢復，易誘發患者術后出現肝功能不全，甚至肝衰竭[55]。

2.6肝臟脂肪變性 Garnol等[56]和Sydor等[57]研究肝臟脂肪變性對部分肝切除術后小鼠肝再生的影響發現，脂肪變性小鼠術后肝細胞的DNA合成量與無脂肪變性的小鼠相比差異無統計學意義，表明肝臟脂肪變性并不影響肝切除術后殘余肝的再生。但有研究表明，無肝病患者與脂肪肝患者比較，肝切除術后早期兩者的殘余肝再生指數差異并無統計學意義，但隨著時間的延長，中重度脂肪肝患者殘余肝再生指數明顯下降，表明肝臟脂肪變性會影響術后殘余肝的再生[58]。肝脂肪變性是否會影響肝切除術后殘余肝的再生，目前尚不清楚，仍有待進一步研究證實。

2.7病毒感染 多項研究表明，乙型肝炎病毒感染會抑制肝臟再生[59-60]。動物實驗證實，乙型肝炎病毒感染大鼠肝切除術后早期，殘余肝細胞會大量分泌IL-6，乙型肝炎病毒感染也會導致殘余肝細胞的STAT3磷酸化，導致SOCS3的轉錄產物大量聚集在肝細胞周圍。而SOCS3轉錄產物聚集造成細胞外信號調節激酶1/2磷酸化，從而抑制肝細胞DNA復制和增殖[61]。

2.8干細胞 Takahashi等[62]從成人成纖維細胞中成功誘導出多能干細胞，這為肝臟疾病的治療開辟了新途徑。Kuijk等[63]將肝細胞移植入肝衰竭大鼠體內，成功改善了大鼠的肝功能，同時發現Igr5很可能是肝干細胞的表面標志物，而Wnt蛋白與維持干細胞功能密切相關。隨著對干細胞研究的深入，已經可以從不同細胞中誘導出多能干細胞，如自體誘導的多能干細胞、間葉細胞誘導的多能干細胞、內源性肝干細胞等，這極大豐富了肝移植的材料來源。研究證實，Wnt信號是維持干細胞特性的重要標志，表面覆蓋Wnt蛋白是干細胞的重要特征[64]。這為干細胞的鑒定提供了依據，也為將來采用肝干細胞在體外培養下構建類肝器官打下了堅實的基礎。

3 小 結

肝切除后肝再生是一個極其復雜的過程。雖然很多學者早已注意到肝切除術后肝臟會出現明顯再生，且再生的程度也與患者的預后相關。近年來，國內外學者們都在專注于研究肝移植術后和肝切除術后肝臟再生的機制，其為肝功能異常的治療開辟了新途徑。采用門靜脈結扎或栓塞、ALPPS等可使預保留的殘余肝在短期內迅速再生，從而允許大范圍的肝切除，又能避免術后肝衰竭的發生，擴大了肝切除的適應人群。肝細胞移植也為先天性肝臟代謝性疾病的治療提供了可能，也許在不久的將來，人們可以采用自己的細胞制作出個體化的人工肝，這將為各種肝病的治療提供新的策略。