miR-346及L1細胞黏附因子在結腸癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系

朱恩宇, 鄭斯卓, 高 凱※, 石 剛，張 睿

(1.遼寧省中醫藥研究院 遼寧中醫藥大學附屬第二醫院外科,沈陽 110034； 2.遼寧省監獄管理局總醫院內科,沈陽 110045； 3.中國醫科大學腫瘤醫院 遼寧省腫瘤醫院結直腸外科，沈陽 110042)

近年來，結腸癌發病率呈上升趨勢并趨于年輕化，但在消化系統惡性腫瘤中，隨著治療觀念的改變及靶向治療的發展，晚期結腸癌的治愈率及生存率均獲得明顯提高[1]。對結腸癌分子生物學機制研究的目的在于對結腸癌進行早期發現、早期診斷、預后分析及探索治療靶點。L1細胞黏附因子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)在子宮內膜癌、食管癌、結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達，對腫瘤的轉移、浸潤及淋巴結轉移等具有調控作用[2-4]。微RNA(microRNA,miRNA)是一類長18～22 nt單鏈非編碼RNA，可特異性識別并與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻譯區(untranslated region,UTR)結合，調控靶mRNA降解，阻礙翻譯過程，調控惡性腫瘤的生物學功能[5]。本研究對miR-346及L1CAM在結腸癌組織中的表達進行檢測，評價其與臨床病理特征的關系及兩者的相關性，目的在于探討其在結腸癌中的生物學行為及對結腸癌預后的評估作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 選取2016年5月至2017年5月于中國醫科大學腫瘤醫院病理標本庫保存的手術切除結腸癌手術標本68例，包括結腸癌組、癌旁組織及正常結腸組織。BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天科技有限公司，L1CAM多克隆抗體購自美國Sigma公司。實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分離試劑盒、All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購自美國Abcom公司。引物由大連寶生生物技術有限公司設計及合成。

1.2免疫組織化學 組織標本置于10%甲醛中固定24 h，脫水后石蠟包埋，4 μm切片，烘干、脫水、脫蠟、抗原修復。在3% H2O2每片50 mL及37 ℃烤箱25 min，采用磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min。加入1∶500一抗后濕盒4 ℃孵育過夜。在室溫條件下復溫20 min，磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min，加二抗37 ℃孵育30 min后二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染5～10 min。自來水洗凈后鹽酸酒精分化10～20 s，流水沖洗30 min。脫水后透明。二甲苯干燥、中性樹膠封片。

1.3實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應 取結腸癌組織標本，按RNA分離試劑盒以及Trizol試劑盒操作說明書提取及純化總RNA，將RNA樣本稀釋至濃度為1 g/L，采用紫外吸收法檢測RNA濃度及純度。應用變性瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA完整性。合成樣品互補DNA，進行梯度稀釋標準品和待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測，繪制梯度稀釋標準曲線DNA模板，實時定量聚合酶鏈反應進行待測基因的檢測，反應體系如下：SYBR Green 1染料10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,脫氧腺苷三磷酸 1 μL,Taq聚合酶2 μL,待測樣品互補DNA 5 μL,雙蒸餾水30 μL,總體積50 μL。將配制好的聚合酶鏈反應溶液置于實時聚合酶鏈反應儀上進行聚合酶鏈反應擴增反應。反應條件：93 ℃預變性2 min，之后94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，73 ℃ 1 min，共40個循環，最后73 ℃ 7 min延伸。采用ΔΔCt法分析溶解曲線。以miR-346/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)吸光度比值進行分析。

1.4結果判定標準 采用陽性細胞著色強度與染色陽性細胞百分比綜合結果進行判斷結果[6]。根據陽性細胞占一個400倍視野中所有細胞總數的百分比：陽性細胞數≤10%計1分；陽性細胞數>10%～50%計2分；>50%～70%計3分；>70%計4分。顯色程度依據陽性強度進行判斷：無染色計0分；淺染棕黃色計1分；較深棕黃色計2分；深棕黃色并且有濃染顆粒計3分。兩項分數之和可定為4個級別：1分計陰性(-)；2～3分計弱陽性(+)；4～5分計中度陽性(++)；6～7分計強陽性(+++)。最終結果以3～7分計為陽性染色。評分由三名具有主任醫師資格的高年資病理科醫師采用盲法完成。腫瘤根據最后結果分為兩組：低表達組包括陰性(-)和陽性(+)；高表達組包括中度陽性(++)和強陽性(+++)。

2 結 果

2.1miR-346、L1CAM mRNA及L1CAM蛋白在組織中的表達 結腸癌組織miR-346表達高于癌旁組織及正常結腸組織(1.272±0.501比0.621±0.168、0.201±0.078)(F=6.524,P<0.001)，癌旁組織與正常結腸組織比較差異無統計學意義(P=0.905)。結腸癌組織L1CAM mRNA表達高于癌旁組織及正常結腸組織(1.035±0.592比0.452±0.122、0.246±0.085)(F=5.183,P<0.001),癌旁組織與正常結腸組織比較差異無統計學意義(P=0.745)。L1CAM蛋白表達于結腸癌細胞膜(圖1a)，在癌旁組織(圖1b)及正常結腸組織(圖1c)中無表達，結腸癌組織中L1CAM蛋白陽性表達率為74.6%(47/68)。結腸癌組織中miR-346與L1CAM mRNA表達呈正相關(r=0.731，P<0.001)，見圖2。

2.2不同臨床病理特征結腸癌患者癌組織中miR-346及L1CAM蛋白表達的比較 不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、病理分型、病理類型患者結腸癌組織中miR-346及L1CAM蛋白的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，而在腫瘤浸潤T3～T4、遠處轉移M1、淋巴結轉移陽性、血管浸潤陽性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及腫瘤分化程度低分化中表達更高(均P<0.05),見表1。

1a:L1CAM蛋白在結腸癌組織高表達；1b:L1CAM蛋白在正常結腸組織無表達；1c:L1CAM蛋白在癌旁組織無表達

圖2 L1CAM mRNA與miR-346的相關性

3 討 論

目前結腸癌發病率呈上升趨勢,早期病情隱匿,難以診斷[7-9]。近年來，隨著對Ⅳ期結腸癌治療方案的改進及靶向藥物的研發，晚期結腸癌治愈率及生存率均得到一定程度的提高，對靶向藥物的探索是結腸癌生存率進一步提高的主要研究方向。隨著分子生物學及基因檢測的發展，為結腸癌的診斷及治療提供了更多的腫瘤標志物、預測靶點及治療靶點[10-12]。L1CAM是跨膜糖蛋白的一種，是免疫球蛋白超家族L1家族中的一員。L1家族成員有L1CAM(CD171)、神經束蛋白、L1CAM相近同系物等[13]。研究顯示,L1CAM參與多種惡性腫瘤發生及發展，調控惡性腫瘤細胞的侵襲、轉移及化療耐藥等過程，對惡性腫瘤的預后具有預測價值[14]。miRNA作為非編碼RNA，通過特異性識別并結合靶mRNA 的3′-UTR參與多種腫瘤發生、發展的多個環節的調控。

表1 不同臨床病理特征結腸癌患者癌組織中miR-346及L1CAM蛋白表達的比較

L1CAM：L1細胞黏附因子；a為F值，余為t值

本研究結果顯示,miR-346在結腸癌組織中表達高于癌旁組織及正常結腸組織。L1CAM mRNA在結腸癌組織中的表達高于癌旁組織及正常結腸組織L1CAM蛋白表達于結腸癌細胞膜，在癌旁組織及正常結腸組織中無表達。結腸癌組織中L1CAM蛋白陽性表達率為74.6%。結腸癌組織中miR-346與L1CAM mRNA表達量呈正相關。這表明，miR-346可能通過調控L1CAM表達介導結腸癌惡性行為。另有研究顯示，L1CAM在子宮內膜癌、結腸癌、食管癌及胰腺癌等惡性腫瘤中表達水平高于相應正常組織，提示腫瘤的預后不良[2-5]。本研究進一步顯示，結腸癌組織中miR-346及L1CAM蛋白高表達者腫瘤浸潤深度、遠處轉移、淋巴結轉移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度均較差,腫瘤浸潤深度T3及T4、遠處轉移、淋巴結轉移、血管浸潤、TNM分期差及腫瘤分化程度差的結腸癌組織中miR-346及L1CAM表達量高。這表明，在結腸癌中，miR-346及L1CAM高表達時，腫瘤侵襲及轉移惡性行為能力增強，可能對腫瘤惡性行為具有促進作用。miRNA通過靶基因對結直腸癌唾液酸化的調控作用，可能在結直腸癌侵襲轉移等惡性行為調控及化療耐藥方面具有重要作用。在中華地鼠卵巢細胞中，L1CAM通過磷脂酰肌醇-3-激酶及細胞外信號調節激酶通路調控糖化過程，調節細胞的增殖及轉移過程[14]。Ito等[15]通過小干擾RNA敲除胃癌細胞中L1CAM表達，在胃癌細胞株中，L1CAM是通過胞外信號調節激酶通路調控胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移的惡性行為。Schirmer等[16]研究顯示，在子宮內膜癌HEC1B細胞中，miR-34a過表達下調L1CAM表達，抑制細胞轉移。p53激活會導致miR-34a上調，L1CAM表達下調,因此miR-34a對L1CAM具有調控作用。miR-34a可以結合到L1CAM mRNA的3′UTR端，L1CAM在轉錄水平受到miRNA調控[17]。通過TGGA數據挖掘、生物信息學檢索及文獻檢索發現，miR-346在惡性腫瘤中的研究較少，miR-346通過抑制乳腺癌轉移抑制因子1表達促進肝細胞癌進展[18]。有研究顯示，在肝細胞癌中miR-346通過SET和MYND域包含蛋白3依賴性通路抑制細胞增殖[19]。miR-346通過靶向作用于Krüppel樣因子4調節神經干細胞增殖及分化[20]。

結腸癌的發生、發展、侵襲轉移及化療耐藥等的機制研究，目前以信號通路的研究及上下游調控基因的發掘為主要方向，靶向治療及免疫治療為腫瘤耐藥提供了新的有效治療方案，針對不同靶點的靶向藥物綜合治療可能是進一步提高晚期結直腸癌生存期的策略。因此，更多治療靶點的發現是進一步擴大靶向治療范圍的主要手段，本研究首先通過生物信息學技術預測miR-346與L1CAM可能具有相關性，L1CAM及miR-346在結腸癌中表達上調,可能對結腸癌轉移及侵襲等惡性行為具有調控作用,兩者可能具有靶向調控關系，成為結腸癌的腫瘤標志物或預測因子，兩者可能具有上下游的調控關系，但兩者的上下游關系和作用機制及是否可以成為靶向治療的治療靶點需進一步通過實驗論證。