高溫液態水預處理結合表面活性劑促進纖維素酶水解玉米芯

戴 莉，劉 凱，韓 峰，艾仕云，周 雙

（1.山東農業大學化學與材料科學學院，山東泰安 271018；2.山東農業大學生命科學學院，山東泰安 271018）

利用現代生物和化學技術，開發和利用可再生的木質纖維素，將其轉化為燃料和化學品，可以降低對不可再生的石油資源的依賴，實現人類社會可持續發展[1-3]。然而，在與自然界長期抗爭的過程中，植物形成了復雜、致密的細胞壁結構，纖維素、半纖維素和木質素以不同的方式共存于細胞壁中，相互緊密交織在一起[4，5]，導致直接降解木質纖維素難度較大，周期長，很難進行高效的工業化應用，因此對生物質進行有效的預處理并在微生物催化轉化過程中加入助劑，以提高其轉化效率十分必要[6-10]。

作為一種環境友好的預處理方式，高溫液態水預處理工藝不需要添加任何其他化學試劑，只利用熱量和水的自催化作用，就可以使生物質中的半纖維素發生降解，從而打破纖維素的天然屏障，增大纖維素可及度，提高纖維素的可降解性和反應活性[11-13]。但是高溫液態水處理過程中，木質素的去除率有限[14，15]，大量殘留的木質素除了形成物理屏障阻礙纖維素和纖維素酶接觸外，還會對纖維素酶進行非反應性吸附，減少降解纖維素的纖維素酶有效數量[16-20]。據報道，非離子表面活性劑能夠維持酶的活力[21]，并可以通過與木質素結合，屏蔽木質素對纖維素酶的非反應性吸附，從而提高木質纖維素的轉化效率[22-24]。因此，本文將天然玉米芯進行高溫液態水預處理后，采用纖維素酶將其催化降解，酶解過程中添加適量的非離子表面活性劑Tween 80，并研究其對酶催化過程的促進方式及效果。

1 實驗部分

1.1 主要材料與化學試劑

玉米芯采自山東省泰安市，自然晾干后粉碎，過篩，封口袋中保存備用。纖維素酶由白銀賽諾生物科技有限公司提供，其內切葡聚糖酶活力為527 IU/g，濾紙酶活力為120 FPU/g，β-葡聚糖苷酶活力為105 IU/g。Tween 80、檸檬酸鈉、檸檬酸、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水硫酸鈉、羧甲基纖維素、葡萄糖、硫氰酸銨、硝酸鈷等均為分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司，使用前未經其他處理。

1.2 高溫液態水預處理

按照1：15的固液比將玉米芯和去離子水加入反應釜，180℃下反應1 h。為防止固體深度降解，到達反應時間后立即用自來水將反應釜冷卻至室溫。反應后的固體部分用去離子水清洗備用。

1.3 玉米芯成分分析和結構表征

玉米芯的表面形貌采用PHENOM PRO型臺式掃描電子顯微鏡觀察，工作電壓5 kV～15 kV，放大倍數為 500 k～10 k。

玉米芯晶相分析在荷蘭帕納科有限公司的X’Pert 3 Powder型X射線粉末衍射儀上進行，Cu靶，Kα輻射源，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描范圍5.0°～40.0°，掃描速度 0.12 °/s。

高溫液態水預處理前后玉米芯的成分參考美國可再生能源實驗室（NREL）的方法進行分析[25，26]。

1.4 纖維素酶催化水解

稱取1 g絕干底物置于250 mL錐形瓶中，按固液比1：50加入0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液，以20 FPU/g（絕干底物）的量加入纖維素酶，加入適量Tween 80后，振蕩均勻并置于50℃、150 r/min的恒溫振蕩器中反應，定期取樣，分別用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）和考馬斯亮藍G 250法（Bradford法）檢測水解液中的還原糖（RS）和蛋白質的含量。纖維素酶吸附率計算式如下：

1.5 Tween 80與玉米芯的吸附

取50 mL 0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液，加入1 g玉米芯，0.1 mL Tween 80，置于恒溫振蕩器中，50℃，150 r/min下震蕩90 min，每隔15 min取樣，上清液采用硫氰酸鈷銨溶液顯色法檢測Tween 80的含量，以不加玉米芯的實驗作為對照組，按照下面的公式計算Tween 80的吸附率：

1.6 Tween 80與纖維素酶的相互作用

分別配制纖維素酶溶液和纖維素酶-Tween 80溶液，用紫外分光光度計在2 000 nm～500 nm范圍內進行掃描，得到兩種溶液的紫外光譜圖。

2 結果與討論

2.1 高溫液態水預處理對玉米芯成分和結構的影響

處理前后玉米芯的表面狀況（見圖1），未處理的玉米芯表面比較平滑，質地緊密，無明顯的纖維素束狀結構。經過高溫液態水預處理后，玉米芯表面結構發生明顯的變化，大量纖維暴露出來，從而增大了比表面積，提高了纖維素的可及度，這對纖維素酶水解纖維素起到積極作用。

處理前后玉米芯結晶度和成分的變化（見表1）。比較發現，處理后玉米芯的結晶度顯著上升，這與基于混合物計算結晶度的方法和處理后成分的變化情況有關。相比天然玉米芯，高溫液態水處理后的玉米芯中，纖維素得到了明顯富集，半纖維素含量顯著減少，僅有5.89%，而纖維素的富集導致結晶纖維素在物料中的比例增大，因此結晶度有所增加。

因此，研究結果表明，高溫液態水處理可以有效降解生物質中大部分半纖維素，為纖維素酶進攻并降解纖維素清掃障礙，然而處理后結晶度上升，且大量木質素保留，這些都會對后期纖維素酶催化降解產生不利影響。

2.2 Tween 80、纖維素酶及酶解底物的相互作用

酶解過程中，木質素除了對纖維素起到物理屏蔽作用外，還會對纖維素酶進行非反應性吸附，而吐溫系列表面活性劑的加入會競爭木質素上的吸附位點，能夠在一定程度上減少木質素對纖維素酶的非反應性吸附[27]。天然玉米芯對Tween 80及纖維素酶的吸附曲線（見圖2）。由圖2A可見，Tween 80在玉米芯上有相當量的吸附，且約15 min后即可達到吸附平衡；而圖2B顯示，玉米芯對纖維素酶的吸附率呈現周期變化，這是因為纖維素酶對纖維素的降解是一個不斷吸附、反應、脫附和再吸附的過程，與前期實驗結果吻合[28]。通過比較發現，約15 min時對照組中玉米芯對纖維素酶吸附率達到最高值，后期纖維素酶吸附規律性較差，周期較長，添加了Tween 80后，初期纖維素酶吸附率略低于對照組，而后期纖維素酶的吸附-解吸附規律性增強，吸附周期縮短，這是由于Tween 80能很快占據木質素上的吸附位點的緣故。結果說明Tween 80的加入能夠有效改善纖維素酶的吸附-解吸附特性。

圖1 預處理前后玉米芯的掃描電鏡圖Fig.1 SEM micrographs of raw（A）and pretreated（B）corncobs

表1 高溫液態水預處理前后玉米芯結晶度和成分變化Tab.1 Changes of corncob crystallinity and composition before and after HLW pretreatment

圖2 天然玉米芯對Tween 80和纖維素酶的吸附Fig.2 Absorption of Tween 80（A）and cellulase（B）by the raw corncob

由纖維素酶以及纖維素酶與Tween 80共存的紫外吸收光譜圖（見圖3）可以看出，由于Tween 80的存在，纖維素酶肽鍵引發的吸收峰由243 nm紅移到253 nm，可能的原因是Tween 80對纖維素酶肽鍵的共價結構產生了影響[29]，同時酪氨酸和色氨酸的出峰位置（280 nm左右）也出現了輕微的變化。由于吸附域的結構變化會影響纖維素酶與底物結合[30]，因此，雖然Tween 80的添加會改善纖維素酶的吸附-解吸附性能以利于水解纖維素，但是加入過量也可能嚴重影響蛋白質結構，從而抑制纖維素酶的活力，因此需要合理優化Tween 80的添加量。

圖3 纖維素酶與Tween 80的紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of cellulase and Tween 80

2.3 表面活性劑添加量對酶解過程的影響

利用未處理的玉米芯進行酶催化水解，并考察Tween 80添加量對水解效果的影響，結果（見圖4），水解72 h后的結果顯示，Tween 80的添加可對酶解過程有改善作用。隨著Tween 80添加量的增大，玉米芯經纖維素酶水解72 h后，水解液中還原糖的濃度逐漸增大；當Tween 80的添加量達到0.1 mL/g絕干底物時，還原糖濃度達到7.41 mg/mL，與未添加Tween 80的對照實驗相比，提高了56.99%；進一步增加Tween 80的量時，還原糖濃度開始下降。由此可見，非離子表面活性劑在改善酶解效率方面存在最佳濃度，這與前面2.2的結論一致。基于本實驗結果，Tween 80的最佳添加量為0.1 mL/g絕干底物。

圖4 Tween 80添加量對酶解過程a的影響Fig.4 Effect of Tween 80 dosage on enzymatic hydrolysis processa

2.4 高溫液態水預處理和Tween 80輔助水解的酶解效果

圖5 高溫液態水處理結合Tween 80對酶解過程的影響Fig.5 Effect of HLW pretreatment combined with Tween 80 on enzymatic hydrolysis processa

未經預處理、無表面活性劑添加的對照組（見圖5），玉米芯酶解產還原糖的量最低，96 h水解液中還原糖的濃度僅為4.50 mg/mL，且由于產物抑制作用，48 h后再延長酶解時間對產糖意義不大；而添加了Tween 80后，不僅酶解全程還原糖濃度有所增加，而且產物的抑制作用也在一定程度上有所減弱，96 h水解液中還原糖濃度比48 h的提高了13.55%；高溫液態水處理后的玉米芯在酶解過程中添加了Tween 80后，酶解效果提升更明顯，96 h水解液中還原糖濃度達到17.36 mg/mL，與對照組相比提升了近三倍。

3 結論

通過前期高溫液態水預處理、后期Tween 80輔助酶解對天然玉米芯進行酶催化降解實驗，發現高溫液態水預處理打破了天然玉米芯致密的結構，有效去除了半纖維素的物理屏障，使纖維素大量裸露，便于纖維素酶對其進攻并加以降解；纖維素酶解過程中合理添加表面活性劑Tween 80，有效屏蔽了木質素的非生產性吸附，改善了纖維素酶吸附-解吸附性質，減弱了產物抑制。二者相結合，最終水解液中還原糖的濃度得到了顯著提高，有效提高了生物質的轉化效率。

將二氧化碳轉化為塑料組分的轉化技術

化石燃料長期以來一直是塑料的前體，但內布拉斯加-林肯大學和歐洲合作者的新研究可能有助于將這個時代推向煙-二氧化碳時代。大氣中完全來自化石燃料燃燒的二氧化碳濃度已從前工業化時代的280×10-6增加到今天的約410×10-6。這種趨勢以及化石燃料的有限供應迫使研究人員探索用二氧化碳而不是用石油或天然氣生產塑料的方法。

內布拉斯加州的Vitaly Alexandrov及其同事詳細介紹了一種基于催化劑的技術，該技術可將二氧化碳轉化為乙烯的量增加一倍，而乙烯是世界上最常見的聚乙烯的重要組成部分。化學和生物分子工程助教Alexandrov說：“二氧化碳的轉化對幫助消除導致全球變暖和環境中其他有害過程的排放非常重要。銅已成為將二氧化碳轉化為聚合物分子的催化化學反應的主要候選者，當施加電壓時，就發生催化反應。但是一些銅基的設置未能將超過約15%的二氧化碳轉化為乙烯，因產率太小而不能滿足工業需求。”

因此，威爾士斯旺西大學的研究人員決定嘗試用不同聚合物涂覆銅，以提高其效率。用聚丙烯酰胺聚合物涂覆銅后，他們發現銅泡沫塑料的轉化率從13%上升到26%。Alexandrov和博士后研究員Konstantin Klyukin隨后通過內布拉斯加州荷蘭計算中心進行基于量子力學的模擬來幫助解釋聚丙烯酰胺設法超越其他聚合物的原因。他們發現聚丙烯酰胺分解CO2并將其重新組裝成一對結合的C-O化合物，然后在它進一步驅動化學反應時穩定新的分子，它們最終生成乙烯。Alexandrov說：“CO2是一個非常難處理的分子，因為它非常難打斷的雙鍵。這是嘗試將CO2轉化為其他分子時最具挑戰性的部分。不要希望花費太多的能量來轉化它，否則，就是一種低效率轉化反應。”研究人員希望進一步提高效率，Alexandrov說，他們瞄準更大的目標是：將二氧化碳直接轉化為能生產塑料袋、容器和薄膜的聚乙烯。Alexandrov說，“實驗主義者要想從簡單分子，如乙烯，用間歇反應合成非常復雜的分子。投入CO2催化劑，最終生成可以在商店銷售的聚合物結構。但這些分子結構非常復雜。這是理解我們創造這種方法的第一步。”

（摘自中外能源2018年第9期）