紫花苜蓿MsOXO基因的克隆及表達分析

許青松，趙 佳，魏運民，韓蓉蓉，劉盧生，蔣曹德，玉永雄，*

(1.西南大學 動物科技學院，重慶 400715； 2.重慶市高校草食動物工程中心，重慶 400715)

紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬多年生牧草，因其優異的飼用價值而被廣泛種植，但病害嚴重威脅苜蓿的栽培[1-3]。三葉草核盤菌(Sclerotiniatrifoliorum)引起的苜蓿菌核病是世界溫帶地區廣為發生的苜蓿病害[4]，染病植株根莖腐爛、枯萎最終死亡[5]。草酸(oxalic acid，OA)是核盤菌關鍵致病因子之一[6]，它可以降低細胞間隙pH，從而增加胞壁降解酶活性并為其他致病因子提供酸性環境[7]；抑制宿主植物的氧化暴發，并促進病原體進入[8]；還可以螯合細胞中的Ca2+，抑制依賴Ca2+的防衛反應，阻斷Ca2+信號通路[9]；也能作用于植物表皮細胞，造成保衛細胞功能紊亂，改變滲透壓，氣孔的不正常開放引起植物葉片萎蔫[10]；還能激發植物細胞程序性死亡[11]。草酸的降解途徑主要是氧化和脫羧。氧化途徑是在草酸氧化酶的作用下氧化草酸，來解除草酸對于寄主的毒害作用，是一種緩解菌核病害的有效途徑。草酸氧化酶(oxalate oxidase，OXO，E.C.1.2.3.4)通過氧化草酸產生H2O2和CO2來解除毒害，在植物抗病防御和生長發育中起著重要作用[12]。目前，對OXO基因的研究主要集中在油菜(Brassicanapus)和小麥(Triticumaestivum)等作物上。Thompson等[13]和Lane等[14-15]的研究表明，小麥萌芽過程中產生的萌發素(germin)是一種具有草酸氧化酶活性的蛋白，后來陸續在大麥(Hordeumvulgare)、花生(Arachishypogaea)、油菜、向日葵(Helianthusannuus)等多種植物中發現這種具有草酸氧化酶活性的germin蛋白[16]。Livingstone等[17]在花生中轉入大麥OXO基因，此基因的表達使得花生葉片在感染菌核病后病斑面積減少75%～97%；Thompson等[18]證明表達了OXO基因的轉基因油菜對草酸有降解作用，阻止了由草酸引起的萎蔫。Liu等[19]對過量表達轉OXO基因油菜進行研究，發現其在接種核盤菌后病斑面積和草酸鹽含量大幅減少，H2O2水平提高，綜合抗菌核病能力提高。Hu等[20]分析轉OXO基因向日葵，發現OXO基因的表達有效增強了向日葵對菌核病的抵抗能力。王冰山等[21]將小麥OXO基因轉入煙草(Nicotianatabacum)，外源OXO基因的表達提高了轉基因煙草離體葉片對草酸的耐受性。胡杰[22]將小麥OXO基因轉入擬南芥(Arabidopsisthaliana)，并通過草酸毒素法與菌絲接種法對轉基因擬南芥進行了抗病分析，結果證明轉OXO基因擬南芥比野生型擬南芥具有更強的抗病性。目前，OXO基因可以提高抗病性這一功能已在多種植物中得到驗證，而苜蓿中OXO基因卻鮮有報道。

本研究通過同源克隆獲得紫花苜蓿OXO基因，利用生物信息學工具對該基因預測分析，通過亞細胞定位來明確該基因作用區域，結合qRT-PCR方法對該基因在紫花苜蓿根、莖、葉中的表達水平進行分析，通過草酸毒素法研究了該基因在各個時間段的表達變化，外源施用植物激素來研究該基因是否受到誘導表達。本研究旨在通過基因工程的方法提高紫花苜蓿對于菌核病的抗性，同時也為其他草酸分泌型病原真菌的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

以渝苜一號紫花苜蓿種子為材料，播種于直徑30 cm盛土花盆中，置于溫室棚中進行正常的養護管理。選取健康、長勢相近枝條進行扦插水培，溫度20 °C，光周期16 h/8 h(L/D)。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、半定量PCR酶Taq、高保真酶PrimeSTAR、熒光定量PCR酶SYBR Premix ExTaqⅡ、T4 DNA Ligase、限制性內切酶SacⅠ、XbaⅠ均購于TaKaRa公司。質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit Ⅰ、膠回收試劑盒Gel Extraction Kit均購于Omega Bio-Tek公司。大腸埃希菌感受態DH5α、農桿菌感受態GV3101均購于北京天恩澤生物技術有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄

用RNAiso Plus提取紫花苜蓿總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量后反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物設計、目的基因克隆

根據蒺藜苜蓿OXO基因序列(Medicagotruncatulaoxalate oxidase，XP_013467999.1)設計引物(OXO-F: 5′-ATGTCCACACAAAAGAACCTTT-3′，OXO-R: 5′-CTACCTTTCTTGTTTAGGATCT-3′)。內參基因根據紫花苜蓿Actin基因設計(Actin-F: 5′-AAAAGGATGCCTATGTTGGTG-3′，Actin-R: 5′-TAAGTGGAGCCTCAGTTAGAAGTA-3′)。利用在線熒光定量引物設計工具IDT設計熒光定量PCR引物(OXO-qF: 5′-CTCCCTCAACTTAGCCATCAC-3′，OXO-qR: 5′-TGGGAGAATGGTGTGAAAGG-3′)。重組載體引物設計為(SacⅠ-OXO-F: 5′-CGAGCTCATGTCCACACAAAAGAACCTTT-3′，XbaI-OXO-R: 5′-GCTCTAGACCTTTCTTGTTTAGGATCTAATTT-3′)(下劃線處為酶切位點)。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

以紫花苜蓿cDNA為模板，OXO-F和OXO-R為引物，對目的基因進行PCR擴增。目的片段經電泳純化回收后連接至pMD19-T載體上，并轉化至大腸埃希菌感受態細胞DH5α，經菌落PCR篩選后挑取陽性克隆，搖菌后提取質粒，將此質粒命名為pMD19T-MsOXO。PCR進一步驗證質粒大小，將驗證正確的質粒送往北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析

使用相關分析工具及數據庫對MsOXO基因及其蛋白進行分析，具體見表1。

1.2.4 基因表達分析

不同處理時間下MsOXO基因表達分析：草酸是菌核病菌等草酸分泌型病原菌引起的植物病變的重要致病因子，核盤菌侵染植株時最先為害根頸及莖基部位，因此采用草酸毒素法對供試材料的根、莖進行處理。經前期預實驗篩選出草酸處理濃度為根部50 μmol·L-1、莖部100 μmol·L-1，此濃度下MsOXO基因正常表達且苜蓿未有明顯受害癥狀。根部處理0、6、12、24、48、72 h后根部取樣，莖部處理0、12、24、48、72 h后莖部取樣，液氮速凍，-80 ℃保存備用。以上處理均重復3次。

不同藥物處理下MsOXO基因表達分析：草酸是核盤菌致病因子，水楊酸(salicylic acid， SA)能夠誘導植物抗病性，是植物防御相關基因表達的激發子，因此本試驗用草酸和水楊酸進行藥物試驗。水楊酸處理濃度參考前人試驗[23-24]。分別用水、50 μmol·L-1草酸、100 μmol·L-1水楊酸處理紫花苜蓿根部。根據不同處理時間下MsOXO在根、莖的表達結果，確定24 h為取樣時間點。根、莖、葉取樣，液氮速凍，-80 ℃保存備用。以上處理均重復3次。

提取以上樣品RNA并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，OXO-qF、OXO-qR為目的基因引物，Actin-F、Actin-R為內參基因引物，采用BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR。用2-△△Ct法處理數據，分析基因表達水平。用SPSS 19.0軟件進行統計分析，GraphPad Prism作圖。

1.2.5 重組載體構建及亞細胞定位

以測序正確的pMD19T-OXO質粒為模板，SacⅠ-OXO-F和XbaⅠ-OXO-R為引物擴增帶有酶切位點目的片段。擴增片段經電泳檢測后回收，連接至pMD19-T載體，并轉化到DH5α感受態細胞，經菌落PCR篩選，陽性菌落經擴大培養后提取質粒，質粒經PCR進一步驗證。用限制性內切酶SacⅠ和XbaⅠ雙酶切上述驗證正確的質粒和植物雙元表達載體pCambia1300-GFP，電泳檢測后回收，T4連接酶16 ℃過夜連接。連接產物轉化DH5α感受態細胞，經菌落PCR篩選后測序。將成功構建的重組載體命名為pCam1300-MsOXO-GFP。

表1生物信息學分析工具及數據庫

Table1Bioinformatics analysis tools and databases

描述Description名稱Name網站Website同源序列Homologous sequenceBLASThttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi理化性質Physical and chemical propertiesProtParamhttp: web.expasy.org/protparam二級結構Secondary structureSOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html跨膜區Transmembrane areaTMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM信號肽Signal peptideSingalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SingalP/三級結構Tertiary structurePDBhttp://www.rcsb.org/pdb/home/home.do功能結構域Functional domainCDDhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi亞細胞定位Subcellular localizationTargetPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/基因組GenomePhytozomehttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Mtruncatula

提取表達載體pCam1300-MsOXO-GFP質粒，凍融法轉化至根癌農桿菌GV3101感受態細胞，PCR篩選陽性菌株。采用農桿菌介導的煙草瞬時表達進行亞細胞定位，用注射器將重懸于侵染液中的農桿菌注射至本生煙草(Nicotianabenthamiana)葉片中，暗培養48 h，正常培養48 h。撕取侵染后煙草葉片下表皮置于OlympusFV 1000激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 MsOXO基因的克隆與序列分析

擴增所得目的片段與預測大小基本一致，目的片段經純化回收連接pMD19-T載體后測序，結果顯示，該序列全長681 bp，編碼226個氨基酸，是一個完整的開放閱讀框(圖1)。BLAST比對分析顯示，該序列與蒺藜苜蓿草酸氧化酶基因MtOXO具有較高的相似性，推測該基因是紫花苜蓿的OXO基因，故命名為MsOXO。

在線工具ProtParam預測分析表明，MsOXO蛋白分子式為C1117H1753N297O324S9，分子質量24 815.54，理論等電點7.06；在氨基酸組成中，亮氨酸占比最高(8.8%)，色氨酸及酪氨酸占比最低(0.4%)。該蛋白的正、負電荷的殘基均為18；不穩定系數29.36(<40)，表明MsOXO為穩定蛋白。

atg，起始密碼子；-，終止密碼子。atg， initiation codon; -， temination codon.圖1 MsOXO的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequences of MsOXO

2.2 信號肽、跨膜區及亞細胞定位分析

通過SOPMA預測MsOXO蛋白的二級結構，其中，α-螺旋占比22.12%，延伸鏈占比25.22%，β-轉角占比7.96%，無規則卷曲占比44.69%(圖2)。經SingalP軟件分析，MsOXO蛋白的C(raw cleavage site score)值為0.700，Y(combined cleavage site score)值為0.804，S(signal peptide score)值為0.981，存在信號肽，剪切位點在24～25殘基處。TMHMM軟件預測結果表明，MsOXO蛋白含有1個跨膜區，其中，1-6位氨基酸位于細胞膜內側，7-24位氨基酸形成一個跨膜螺旋區，25-226位氨基酸在膜外側。因此，信號肽(1-24位氨基酸)被切除后余下的25-226位氨基酸構成的新蛋白質完全位于膜外。

經TargetP軟件分析，MsOXO蛋白的SP(secretory pathway)分值達0.848，為最高，表明MsOXO蛋白屬于分泌蛋白。采用農桿菌介導的煙草瞬時表達，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MsOXO蛋白，結果顯示綠色熒光集中在細胞壁上(圖3)。

2.3 功能結構域及三級結構分析

CDD在線分析表明，MsOXO蛋白存在1個保守結構域，特異性位點為Cupin-1，屬于Cupin超家族，這一家族都含有由β-折疊構成的桶狀結構，Germin是這個家族成員之一。說明MsOXO作為具有草酸氧化酶活性的Germin，其存在Germin家族的保守結構域。利用PDB預測MsOXO蛋白三級結構，結果顯示，MsOXO高分子實體為草酸氧化酶，配體為Mn2+，是一個含錳同型六聚體(圖4)。OXO由2個三聚體形成2個結構域，每個三聚體單體通過相互之間疏水作用和互鎖平面保持整個蛋白的穩定性，每個單體含1個Mn(Ⅱ)，其與3個His、1個Glu結合，再與2個分水子配位成球，構成OXO的活性中心[25-26]。

2.4 MsOXO同源性及系統發育分析

將MsOXO蛋白序列在線BLAST比對得到90多個同源序列，其與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)、木豆(Cajanuscajan)、綠豆(Vignaradiata)、赤豆(Vignaangularis)的OXO基因均有較高相似性，分別為97%、81%、78%、78%、77%、77%。將以上氨基酸序列經Clustal X及DNAMAN軟件進行同源序列比對(圖5)。

圖中線條由高到低依次表示α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規則卷曲。The lines in the figure were alpha helix， extended strand， beta turn and random coil in descending order.圖2 MsOXO蛋白質的二級結構預測Fig.2 Secondary structure prediction of MsOXO protein

A，明場圖；B，熒光圖；C，疊加圖。A， Bright field; B， Fluorescent vision; C， merged vision.圖3 MsOXO蛋白亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of MsOXO protein

圖4 紫花苜蓿MsOXO蛋白三維結構預測圖Fig.4 Predicted 3D structure of MsOXO protein

根據同源性分析結果，選擇了20個相似性大于70%的氨基酸序列，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法(neighbor joining)構建系統進化樹(圖6)。由進化樹可知，絕大多數相同科的植物聚為一類，紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)等同為豆科(Leguminosae)的聚為一類；青梅(Prunusmume)、山杏(Prunusarmeniaca)、甜櫻桃(Prunusavium)等薔薇科(Rosaceae)聚為一類；長蒴黃麻(Corchorusolitorius)和榴蓮(Duriozibethinus)雖屬不同科但在聚類分析中聚為一類，說明MsOXO編碼蛋白在同一科屬間有很高同源性，不同科間也有一定的同源性，推測OXO編碼蛋白在進化上較保守。

2.5 MsOXO基因表達分析

實時熒光定量PCR結果顯示：50 μmol·L-1草酸處理根后，紫花苜蓿根系中MsOXO表達量在0到72 h內呈先升高后降低趨勢，并在12 h達到最大，顯著(P<0.05)高于其他時間點表達量，24 h的表達量次之；100 μmol·L-1草酸處理莖后，紫花苜蓿莖中MsOXO表達量大體呈先升高后降低趨勢，在48 h達到最大，顯著(P<0.05)高于其他時間點表達量，說明在外源草酸處理下紫花苜蓿的MsOXO表達量均增加(圖7)。

根據上述不同處理時間下MsOXO表達結果，為了使根、莖部位MsOXO基因表達量均達到較高水平，因此在進行不同藥物處理試驗時選取24 h為取樣時間點。試驗結果表明，MsOXO基因在無處理的對照紫花苜蓿根、莖、葉中均有表達，在葉中表達量最多且顯著(P<0.05)高于根莖，約為根的1.5倍；經50 μmol·L-1草酸浸根處理后，根、莖中MsOXO基因表達量均顯著(P<0.05)升高，葉中表達量與對照組差異不顯著；經100 μmol·L-1水楊酸處理后的根、莖、葉中MsOXO表達量較對照均升高，除根外，莖葉表達量較對照升高不顯著。總體上，水楊酸處理使得MsOXO基因在根、莖、葉中上調表達(圖8)。

圖5 MsOXO基因編碼氨基酸與其他物種相似氨基酸序列比對Fig.5 Homology analysis of amino acid sequence encoded by MsOXO and samilar amino acid sequences from other plant species

圖6 MsOXO蛋白與其他物種OXO蛋白系統進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of MsOXO protein and OXO protein from other species

3 討論

A，50 μmol·L-1草酸處理苜蓿根部后根中MsOXO表達情況；B，100 μmol·L-1草酸處理苜蓿莖部后莖中MsOXO表達情況。不同柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A， Expression of MsOXO in the root of the alfalfa after 50 μmol·L-1 OA treatment; B， Expression of MsOXO in the stem of the alfalfa after 100 μmol·L-1 OA treatment. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖7 不同濃度草酸處理下MsOXO基因表達情況Fig.7 Analysis of MsOXO gene expression under different concentrations of OA

圖8 草酸、水楊酸處理下MsOXO基因表達情況Fig.8 Expression of MsOXO gene under OA and SA treatments

本研究通過蒺藜苜蓿OXO基因同源克隆獲得了紫花苜蓿草酸氧化酶基因MsOXO。其具有草酸氧化酶的典型結構域，是一個含錳同型六聚體，與同屬豆科的大豆、鷹嘴豆、羽扇豆等OXO基因有較高的相似度。生物信息學分析結果表明，其為分泌蛋白，亞細胞定位結果顯示MsOXO蛋白定位于細胞壁，此結果與前人研究相一致[27]。MsOXO的亞細胞定位結果可為研究其功能及機制提供重要參考信息，推測MsOXO作為分泌蛋白在胞外解除草酸的毒害，同時產生H2O2阻止病原真菌進一步損害宿主植物。MsOXO在細胞壁上，可以在胞外將草酸分解，防止胞壁水解酶活性上升破壞細胞壁，同時阻止草酸調控保衛細胞，也阻止草酸進入細胞危害植物。氧化草酸產生的H2O2發生的氧化作用可以直接在胞外殺死病原菌[30]，還能夠引起細胞壁結構蛋白破壞發生融合以阻礙病菌直接進入細胞[28]。病原微生物侵染植物時分泌的草酸造成pH下降，當pH降到3～5時，由Glu和Asp構成的帶負電氨基酸殘基通道打開，使草酸接近活性中心，OXO分解草酸使pH升高，升至中性時通道關閉[25]。

植物可以通過誘導一系列防御機制來抵抗病原菌。水楊酸是植物防御相關基因表達的激發子又是重要的內源信號分子，當植物受到環境脅迫時可誘導一系列防御相關基因的表達而表現出對植物的保護作用。適宜濃度外源水楊酸可以提高苜蓿的抗病性[29]、抗旱性[24]、耐鹽性[31]及對低溫的抵抗能力[32]。本試驗用外源水楊酸處理苜蓿根部，處理24 h后的組織中MsOXO基因均上調表達，證明水楊酸對MsOXO基因有誘導表達作用。MsOXO分解病原真菌產生的草酸生成H2O2，繼而產生誘導超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(POD)等抗氧化酶活性提高，增強植物對病菌的耐受性[33-34]。水楊酸作為信號系統介質對H2O2的產生及編碼保護蛋白的基因表達有影響[35]。有研究表明，水楊酸預處理后的小麥種子在感染了穎枯病后，其葉片組織中編碼草酸氧化酶和陰離子過氧化氫酶的基因表達增加[36]。根據多年田間觀察，西南地區紫花苜蓿菌核病一般在晚秋和(或)早春發生，且根頸和莖基部最先被侵染，然后蔓延。本研究中發現，MsOXO在紫花苜蓿的根、莖、葉中均有表達，在根莖中表達較低，這也許是紫花苜蓿菌核病首先侵染根莖的原因。以上分析表明，MsOXO基因可能在紫花苜蓿抵御菌核病害中發揮作用。本研究通過對紫花苜蓿草酸氧化酶MsOXO基因的初步分析，為草酸分泌型真菌病害的研究提供參考。