白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對破骨細(xì)胞分化的抑制作用

徐 元， 陳 龍， 章丹丹?

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院， 上海201203； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心分析測試室， 上海

201203）

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 慢性病毒感染、 腫瘤等疾病的發(fā)展過程中都伴有骨密度減少、 破骨細(xì)胞異常活化［1-3］， 同時乳腺癌、 肺癌、 前列腺癌晚期常見骨轉(zhuǎn)移， 其一旦發(fā)生將伴發(fā)病理性骨折、 脊髓壓迫、疼痛等， 降低患者生活質(zhì)量， 甚至危及生命［4］。破骨細(xì)胞的分化依賴成骨細(xì)胞產(chǎn)生的核因子-κB 受體活化因子配體（RANKL） 與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的核因子κB 受體活化因子（RANK） 相互作用活化， 兩者結(jié)合后促進骨吸收， 并抑制破骨細(xì)胞凋亡［5］。

中醫(yī)藥在干預(yù)乳腺癌等腫瘤中， 不僅可抑制腫瘤生長， 在轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)還具有延緩骨轉(zhuǎn)移發(fā)生及減少溶骨性損傷的作用。 中醫(yī)認(rèn)為， 腫瘤屬于“巖證”“惡核” “石瘕” “石疽” 等范疇， 清熱解毒、 活血化瘀、 扶正祛邪、 軟堅散結(jié)、 化痰祛濕等是中醫(yī)治療腫瘤的常用方法［6］。 白花蛇舌草味甘、 淡，性涼， 具有清熱解毒、 利尿消腫、 活血止痛之功效［7］； 半枝蓮味辛、 苦， 性寒， 具有清熱解毒、散瘀活血之功效［8］， 兩者均為清熱解毒藥， 臨床上常相須為用以治療各種炎癥、 腫瘤等。 現(xiàn)代藥理研究表明， 兩者提取物或所含成分對結(jié)直腸癌、 肝癌、 膀胱癌等均具有抑制作用［9-11］， 也是乳腺癌治療的核心藥對［12］， 但尚未開展其對破骨細(xì)胞分化及腫瘤骨轉(zhuǎn)移的研究。 前期預(yù)實驗對白花蛇舌草-半枝蓮藥對不同配比提取物及其不同極性組分進行活性導(dǎo)向的追蹤分離， 發(fā)現(xiàn)等比提取的乙酸乙酯組分抑制體外破骨細(xì)胞分化活性最強， 故本實驗基于RANKL 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分化作為破骨細(xì)胞模型， 探討該組分抑制破骨細(xì)胞分化的機制， 為其臨床治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移或其他骨性疾病提供參考。

1 材料

1.1 試藥 白花蛇舌草（批號050815）、 半枝蓮（批號050621） 飲片購自上海養(yǎng)和堂藥業(yè)連鎖經(jīng)營有限公司， 經(jīng)上海市食品藥品檢驗所專家鑒定為正品（報告書編號20080338、 20080337）。 對羥基苯乙酮、 野黃芩苷、 木犀草素、 芹菜素由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)課題組提供， 含有量均＞98%。 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 購自美國ATCC公司； RPMI-1640 培養(yǎng)基干粉購自美國Gibco 公司； 胎牛血清購自美國HyClone 公司； 噻唑藍（MTT）、 二甲基亞砜（DMSO）、 Trizol RNA 提取試 劑、 HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits、 miR-155 引 物 套 裝 及 TaqMan Small RNA Assays 購自美國Life Technologies 公司； RealMaster-Mix SYBR Green 試劑盒購自美國羅氏公司；RANKL 購自美國Peprotech 公司； PVDF 膜購自美國Millipore 公司； BCA 蛋白濃度測定試劑盒、 抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP） 染色試劑盒購自美國Sigma 公司； RANK、 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 （TRAF6）、 活化T 細(xì)胞核因子cl （NFATc1）、 組織蛋白酶K 抗體購自美國Santa Cruz 公司； 引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。 其他溶劑均為分析純， 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 Delta Series 生物安全柜 （美國Labconco 公司）； CO2培養(yǎng)箱、 高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo 公司）； 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）； Centrifuge 5810R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）； Cellometer Auto T4 全自動細(xì)胞計數(shù)儀（美國Nexcelom 公司）； Spectra MAX190 酶標(biāo)儀（美國MD 公司）； QB-9006 恒溫微孔板快速振蕩器（海門市其林貝爾儀器有限公司）； 7500Fast System熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；PowerPacTMHC 電 泳儀 （美國Bio-Rad 公司）；Tanon NIM2045 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）； UPLC （美國Waters 公司）。

2 方法

2.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分（YDW11） 制備及成分鑒定 白花蛇舌草、 半枝蓮以1 ∶1 比例加水提取， 取適量浸膏溶于蒸餾水中，乙酸乙酯萃取， 即得相應(yīng)組分。

取適量YDW11 溶于DMSO 溶液中， 離子源噴霧電壓正、 負(fù)離子模式下分別為3.5、 3.2 kV； 毛細(xì)管溫度350 ℃； 鞘氣、 輔助氣體積流量35、15 arb （1 arb ＝0.3 L／min）； 反 吹 氣 體 積 流 量1 arb； 離子源霧化溫度300 ℃。 S-Lens 級別60；離子檢測方式全掃描（Full Scan）， 分辨率60 000。二級采用10 個峰的DDA 檢測模式（數(shù)據(jù)依賴分析模式）； 分辨率15 000； 碰撞能35 eV； 動態(tài)排除時間10 s。

YDW11 以5 mg／mL 質(zhì)量濃度溶于甲醇中進行UPLC 分析， 條件為Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱； 流動相乙腈-0.1%甲酸； 柱溫40 ℃。

2.2 YDW11 對細(xì)胞活力的影響 RAW264.7 細(xì)胞以1×104／100 μL 密度接種于96 孔板中， 培養(yǎng)過夜， 設(shè) 置 對 照 組、 模 型 組、 YDW11 組 （25、50 μg／mL）， 刺激處理24 h 后棄去上清， 每孔加入RPMI 1640 100 μL、 MTT （PBS 溶解為5 g／L）10 μL， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清， 加入100 μL DMSO， 置于搖床上至結(jié)晶完全溶解， 酶標(biāo)儀讀取490 nm 下 吸 光 度， 以 對 照 組 為100%， 計 算YDW11 對細(xì)胞活力的影響。 每組設(shè)3 個復(fù)孔， 實驗重復(fù)3 次。

2.3 YDW11 對陽性多核細(xì)胞數(shù)的影響 RAW264.7 細(xì)胞在10%FBS1640 條件下以10 000／孔培養(yǎng)于24 孔板中， 分組同“2.2” 項， 貼壁生長過夜， 第2 天在相同條件下加藥物預(yù)處理24 h， 第3 天在相同條件下加入誘導(dǎo)劑RANKL （終質(zhì)量濃度100 ng／mL）， 再加入藥物進行處理， 隔天換液并加入上述誘導(dǎo)劑和藥物， RANKL 誘導(dǎo)處理7 d后根據(jù)TRAP 染色試劑盒說明書進行染色， 200 倍鏡下隨機選取5 個視野觀察細(xì)胞分化情況， 具有3個及3 個以上細(xì)胞核的多核細(xì)胞認(rèn)定為破骨樣細(xì)胞， 對其進行計數(shù)， 并進行典型破骨樣細(xì)胞圖像采集。 實驗重復(fù)3 次。

2.4 TRAP 活性檢測 RAW264.7 細(xì)胞在10%FBS1640 條件下以10 000／孔培養(yǎng)于24 孔板中， 分組同“2.2” 項， 貼壁生長過夜， 第2 天在相同條件下加藥物預(yù)處理24 h， 第3 天在相同條件加入誘導(dǎo)劑RANKL （終質(zhì)量濃度100 ng／mL）， 再加入藥物進行處理， 隔天換液并加入上述誘導(dǎo)劑和藥物，誘導(dǎo)處理7 d 后棄去上清， PBS 洗滌1 次后每孔加入100 μL PBS， 刮取細(xì)胞并收集細(xì)胞懸液， 150 W下超聲3 次， 每3 s 間歇2 s， 超聲后4 ℃、12 000 r／min下離心15 min， 取上清， 根據(jù)TRAP試劑盒說明書檢測TRAP 活性， 同時采用BCA 蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。 實驗重復(fù)3 次。

2.5 YDW11 對TRAP、 樹突狀細(xì)胞-特異性跨膜蛋白（DC-STAMP）、 NFATc1 基因表達的影響

RAW264.7 細(xì)胞在10%FBS1640 條件下以10 000／孔培養(yǎng)于24 孔板中， 分組同“2.2” 項， 貼壁生長過夜， 第2 天在洗脫條件下加藥物預(yù)處理24 h， 第3 天在相同條件下加入誘導(dǎo)劑RANKL （終質(zhì)量濃度100 ng／mL）， 再加入藥物進行處理， 隔天換液并加入上述誘導(dǎo)劑和藥物， 誘導(dǎo)處理7 d 后收集RNA 樣品， Trizol 法提取RNA， 根據(jù)樣品吸光度計算RNA 濃度， 將其調(diào)整至500 ng／μL， 按RT 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)成cDNA 樣品后， 根據(jù)PCR 試劑盒說明書進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 實驗重復(fù)3 次， 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 YDW11 對RANK、 TRAF6、 NFATc1、 組織蛋白酶K 蛋白表達的影響 RAW264.7 細(xì)胞在10%FBS1640 條件下以10 000／孔培養(yǎng)于24 孔板中， 分組同“2.2” 項， 貼壁生長過夜， 第2 天在相同條件下加入藥物預(yù)處理24 h， 第3 天在相同條件下加入誘導(dǎo)劑RANKL （終質(zhì)量濃度100 ng／mL）， 再加入藥物進行處理， 隔天換液并加入上述誘導(dǎo)劑和藥物， 誘導(dǎo)處理7 d 后收集蛋白， 100 W 下超聲3次， 每3 s 間歇2 s， 超聲后4 ℃、 12 000 r／min 下離心15 min， 取上清， BCA 蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度， 每孔上樣30 μg 蛋白， 在SDSPAGE 凝膠中電泳， 轉(zhuǎn)膜后5% 牛奶封閉， 檢測RANK、 TRAF6、 NFATc1、 cathepsin K 蛋白表達。實驗重復(fù)3 次。

2.7 YDW11 對miR-155 表達的影響 RAW264.7細(xì)胞在10%FBS1640 條件下以10 000／孔培養(yǎng)于24孔板中， 分組同“2.2” 項， 貼壁生長過夜， 第2天在相同條件下加入藥物預(yù)處理24 h， 第3 天在相同條件下加入誘導(dǎo)劑RANKL （終質(zhì)量濃度100 ng／mL）， 再加入藥物進行處理， 隔天換液并加入上述誘導(dǎo)劑和藥物， 誘導(dǎo)處理7 d 后收集RNA樣品， 采用Trizol 法提取總RNA， 根據(jù)Taqman Small RNA 試劑盒說明書， 各樣品取10 ng 總RNA， 逆轉(zhuǎn)成cDNA 后進行PCR 反應(yīng)， 檢測miR-155 表達。 實驗重復(fù)3 次。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS21.0 軟件進行處理，組間資料比較采用單因素方差分析， 計量資料以（±s） 表示。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 成分鑒定 YDW11 中可能含有16 種成分。通過比較YDW11 和各成分UPLC 色譜圖（圖1），鑒定出對羥基苯乙酮、 野黃芩苷、 木犀草素、 芹菜素。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of various constituents

3.2 YDW11 對細(xì)胞活力的影響 圖2 顯示， 與對照組比較， YDW11 組對細(xì)胞活力無明顯影響（P＞0.05）。

圖2 YDW11 對細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of YDW11 on cell viability

3.3 YDW11 對陽性多核細(xì)胞數(shù)的影響

RAW264.7 細(xì)胞體積較小， 鏡下觀察呈圓形、 多角形等， 一般只含有1 個細(xì)胞核， 極少數(shù)有2 個核，TRAP 染色陰性； 與單核巨噬細(xì)胞比較， 破骨細(xì)胞體積明顯增大， 部分細(xì)胞質(zhì)可見空泡狀， 細(xì)胞核數(shù)≥3，TRAP 染色陽性。 圖3 顯示， 對照組無明顯TRAP染色陽性多核細(xì)胞（細(xì)胞核≥3）， 模型組顯著增加（P＜0.01）， YDW11 組顯著減少（P＜0.01）。

3.4 YDW11 對TRAP 酶活性的影響 圖4 顯示，與對照組比較， 模型組酶活性顯著升高 （P ＜0.05）； 與模型組比較， YDW11 組酶活性有所降低， 以50 μg／mL 組更顯著（P＜0.05）。

圖3 YDW11 對陽性多核細(xì)胞數(shù)的影響（×200）Fig.3 Effect of YDW11 on positive polykaryocyte count （×200）

圖4 YDW11 對TRAP 酶活性的影響Fig.4 Effect of YDW11 on TRAP enzyme activity

3.5 YDW11 對TRAP、 DC-STAMP、 NFATc1 基因表達的影響 圖5 顯示， 與對照組比較， 模型組TRAP、 DC-STAMP、 NFATc1 基因表達顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， YDW11 組三者基因表達有所降低， 以50 μg／mL 組更顯著 （P ＜0.05，P＜0.01）。

3.6 YDW11 對RANK、 TRAF6、 NFATc1、 組織蛋白酶K 蛋白表達的影響 圖6 顯示， 與對照組比較， 模型組RANK、 TRAF6、 NFATc1、 組織蛋白酶蛋白表達顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）； 與模型組比較， YDW11 組三者蛋白表達顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）， 并呈劑量依賴性。

圖5 YDW11 對TRAP、 DC-STAMP、 NFATc1 基因表達的影響Fig.5 Effects of YDW11 on TRAP， DC-STAMP， NFATc1 gene expressions

圖6 YDW11 對RANK、 TRAF6、 NFATc1、 組織蛋白酶K 蛋白表達的影響Fig.6 Effects of YDW11 on RANK， TRAF6， NFATc1， cathepsin K protein expressions

3.7 YDW11 對miR-155 表達的影響 圖7 顯示，與對照組比較， 模型組miR-155 表達顯著下降（P＜0.05）； 與模型組比較， YDW11 組其表達有所升高， 以50 μg／mL 組更顯著（P＜0.01）。

圖7 YDW11 對miR-155 表達的影響Fig.7 Effect of YDW11 on miR-155 expression

4 討論

骨是一個代謝活躍的器官， 在整個生命周期中都在進行不斷的更新和改進。 正常情況下， 成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)合成、 破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收維持著骨完整性的平衡， 數(shù)量與活性正常的兩者對正常的骨轉(zhuǎn)換至關(guān)重要， 若功能失調(diào)將導(dǎo)致骨骼形態(tài)結(jié)構(gòu)異常， 如骨質(zhì)疏松時骨量減少， 而骨硬化癥時骨量增多， 當(dāng)骨形成動態(tài)平衡被打破， 破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成時， 就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松［13］。 由在腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時， 常伴有骨密度減少及破骨細(xì)胞異常活化， 故防治骨質(zhì)疏松最重要的方式之一就是抑制破骨細(xì)胞活性、 減少骨吸收。

酸性磷酸酶也稱為酸性磷酸酯酶， 在酸性條件下可催化磷酸酯鍵水解， 其主要分為兩類， 一類是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）， 一類是抗氟離子酸性磷酸酶［14］， 其中前者是一種糖基化的含金屬蛋白酶， 主要存在于巨噬細(xì)胞、 破骨細(xì)胞、Gaucher 細(xì)胞、 紅細(xì)胞、 血小板、 脾臟毛狀細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞中， 但在肺泡巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞中含有量最豐富， 而單核細(xì)胞的前體則不含該酶［15］，它在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、 細(xì)胞增殖、 分化等方面起到重要作用［16］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)核因子-κB 受體活化因子配體（RANKL） 處理7 d 后， 模型組中存在大量破骨細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀、 細(xì)胞核數(shù)目≥3、 體積明顯增大、 TRAP 染色陽性）， 但在白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分（YDW11） 干預(yù)下破骨細(xì)胞明顯減少， 同時TRAP 表達及酶活性也被顯著抑制。

核因子-κB 受體活化因子（RANK） 是由其配體RANKL （TRANCE／OPGL／ODF） 激活的在樹突細(xì)胞上鑒定的TNFR 家族成員， 可促進樹突狀細(xì)胞存活和破骨細(xì)胞分化［13］。 RANKL 促進破骨細(xì)胞前體分化的過程中， 能誘導(dǎo)活化T 細(xì)胞核因子cl（NFATcl）、 樹突狀細(xì)胞-特異性跨膜蛋白 （DCSTAMP） 表達， 而且前者可通過后者上調(diào)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞間的融合， 從而促進破骨細(xì)胞分化［17］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 （TRAF6） 是NF-κB受體活化因子（RANK） 的重要銜接分子， 它與RANK 的耦聯(lián)對破骨細(xì)胞骨吸收功能的維持至關(guān)重要［18］； 組織蛋白酶K 是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶， 被認(rèn)為在骨再吸收過程中由破骨細(xì)胞特異性表達［19］。 本實驗證實， YDW11 可顯著抑制破骨細(xì)胞分化重要蛋白和基因的表達， 抑制破骨細(xì)胞分化。

miRNA 是一種在細(xì)胞分化、 組織發(fā)育階段特異性表達， 主要參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA， 可通過與mRNA 配對調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達使得翻譯抑制或mRNA 降解， 在許多生理或病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用， 包括細(xì)胞分化、 免疫發(fā)展、 癌癥轉(zhuǎn)化等［20-21］。 研究表明， 多種miRNA 在破骨細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮了重要作用，如miR-223、 miR-21、 miR-503、 miR-155 等［2］， 其中miR-155 作為miRNAs 家族一員， 是一種炎癥相關(guān)的多功能microRNA， 與免疫功能和細(xì)胞凋亡有關(guān)， 活化T 細(xì)胞、 B 細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)其表達［20］。 研究表明， 在RAW264.7 向破骨細(xì)胞分化時， miR-155 表達顯著下降， 而提升其表達可使破骨細(xì)胞分化受到抑制［22］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)RANKL處理7 d 后， 模型組中miR-155 表達顯著降低， 而YDW11 在50 μg／mL 劑量下可大大提升其表達。

中藥復(fù)方配伍靈活多變， 可依據(jù)癥狀種類及輕重辨證論治， 隨證加減， 藥對是中藥諸多配伍形式中的一種， 為其最小單位［23］。 課題組前期對白花蛇舌草-半枝蓮藥對不同部位組分進行提取分離，尋找活性部位或成分， 并對其中的化學(xué)成分進行初步分析和質(zhì)量控制， 有助于該藥對藥用價值的進一步開發(fā)。

綜上所述， YDW11 可通過上調(diào)miR-155 表達、下調(diào)相關(guān)基因和蛋白表達抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化， 提示其具有抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移的潛能， 可為臨床相關(guān)治療提供一定參考。