人參提取物對(duì)Ⅰ型干擾素及下游基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

邊 帥， 孫 雪， 韓小偉， 趙大慶， 王佳雯

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)， 吉林省人參科學(xué)研究院， 吉林 長(zhǎng)春130117）

目前， 已知人體產(chǎn)生的干擾素共有13 種， 分為Ⅰ型、 Ⅱ型、 Ⅲ型三大家族， 其中Ⅰ型干擾素以干擾素-α、 干擾素-β 為主， 由先天性免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞） 分泌， 是參與抗病毒免疫的重要效應(yīng)分子； Ⅱ型干擾素為干擾素-γ， 主要由活化后的T 細(xì)胞分泌產(chǎn)生； Ⅲ型干擾素為幾種干擾素-λ， 其已知的分布與功能都比較有限［1］。 Toll樣受體及維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體途徑是機(jī)體感染后產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的兩大主要途徑， 可利用胞內(nèi)信號(hào)分子傳遞來激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3／7， 從而啟動(dòng)Ⅰ型干擾素基因表達(dá)［2］。 另外， 干擾素可通過促進(jìn)下游一些干擾素刺激基因表達(dá)來達(dá)到抑制病毒復(fù)制的能力， 這些基因所編碼的蛋白包括Mx1 蛋白、BST-2 蛋白、 APOBEC 家族蛋白、 TRIM 蛋白等［3］。

近年來， 對(duì)人參提取物及皂苷抗病毒的研究有了初步進(jìn)展， 發(fā)現(xiàn)人參提取物及人參皂苷對(duì)多種病毒的感染及病毒感染后的細(xì)胞炎癥或凋亡有一定抑制作用， 其中人參皂苷Re、 Rf、 Rg2能抑制柯薩奇病毒CVB3、 人鼻病毒HRV3、 腸道病毒EV71 感染［4］； Rb1、 Rg1處理細(xì)胞后顯著降低貓杯狀病毒FCV 和人甲肝病毒HAV 的感染率［5-6］； Rg3 能通過刺激TRAF6／TAK1 降解和抑制JNK／AP-1 信號(hào)通路來影響人乙肝病毒HBV 復(fù)制［7］； Rb2、 Rg3能保護(hù)新生小鼠免受輪狀病毒的感染［8］。 同時(shí)， 人參提取物作用于細(xì)胞時(shí)， 可減少H9N2 型流感病毒感染所帶來的細(xì)胞凋亡和DNA 損傷［9］； 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人參提取物的預(yù)處理可降低鼠諾如病毒MNV 和FCV的感染［10］； 紅參對(duì)HIV-1 患者生存期具有一定的延長(zhǎng)作用［11］， 這可能是通過調(diào)控一種或多種宿主抗病毒蛋白來完成， 如廣譜抗病毒的APOBEC3G（A3G）、 BST-2 等因子， 從而限制了多種病毒的感染。

本實(shí)驗(yàn)以人參提取物為對(duì)象， 通過考察其對(duì)THP-1 細(xì)胞的作用來檢測(cè)Ⅰ型干擾素表達(dá)和分泌變化， 同時(shí)測(cè)定下游抗病毒因子表達(dá)， 在分子水平上研究其抗病毒具體機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞和試劑 人單核細(xì)胞THP-1 （編號(hào)TIB-202）、 HEK293T （編號(hào)CRL-11268） （ATCC 細(xì)胞庫(kù)）； DMEM 高糖培養(yǎng)基 （編號(hào)SH30022.01）、1640 培養(yǎng)基 （編號(hào)SH30809.01）、 雙抗 （編號(hào)SV30010） （美國(guó)Hyclone 公司）； 胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司， 16000-044）； DMSO （北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司， 編號(hào)77H00150）； Trizol（ 美 國(guó) Thermo Fisher Scientfic 公 司， 編 號(hào)15596026）； 轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE siRNA （瑞士Roche 公司， 編號(hào)04476093001）； ELISA 試劑盒（美國(guó)Cloud-Clone Corp 公司， 編號(hào)SEA033Hu、SEA222Hu）； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，編號(hào)RR037 A）； siRNA （上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）； PCR 引物（長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）； 生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）； Infinite?200 Pro 多功能微孔板分析儀（瑞士Tecan公司）； Real-Time PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 人參提取物制備 干燥人參根（產(chǎn)地吉林撫松） 粉碎-煎煮-濃縮-噴霧干燥-粉碎-過篩。 然后，取100 mg 成品（約為10 g 生藥材） 溶于1 mL 無菌水中， 37 ℃下助溶， 測(cè)得人參總皂苷含有量≥10%。

2.2 干擾素分泌水平檢測(cè) THP-1 細(xì)胞接種于24孔板 中， 加 入 人 參 提 取 物 （ 終 質(zhì) 量 濃 度0.5 mg／mL）， 48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液， 離心去除細(xì)胞， 取上清液， 通過ELISA 法檢測(cè)干擾素-α、干擾素-β 分泌情況。 操作過程如下： （1） 各組分和樣品置于室溫下； （2） 稀釋對(duì)照品； （3） 將樣品和對(duì)照品分別加入孔板中， 37 ℃下孵育2 h；（4） 移除液體， 加入稀釋過的一抗， 37 ℃下孵育1 h； （5） 移除液體， 洗滌3 次； （6） 加入稀釋過的二抗， 37 ℃下孵育0.5 h； （7） 移除液體， 洗滌5 次； （8） 加入顯色液， 37 ℃下孵育10 ～20 min，避光； （9） 加入終止液， 450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算干擾素-α、 干擾素-β 濃度。

2.3 基因表達(dá)檢測(cè) THP-1 細(xì)胞接種于24 孔板中， 加入人參提取物， 24 h 后收集細(xì)胞， Trizol 法提取RNA 并檢測(cè)其濃度， 通過逆轉(zhuǎn)錄酶及Oligo（dT） 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR， 獲得cDNA。 然后， 應(yīng)用熒光標(biāo)記試劑和特異性引物， 通過熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增， 收集數(shù)據(jù)， 分析相對(duì)mRNA 量。 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)溫度37 ℃， CO2體積分?jǐn)?shù)5%； HEK293T 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)溫度37 ℃， CO2體積分?jǐn)?shù)5%。 然后， 使用X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑， 按照使用說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，樣本率比較采用卡方檢驗(yàn)， 樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)的方差分析。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參提取物對(duì)Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)作用 圖1顯示， 與空白組比較， 人參提取物組干擾素-α 分泌水平顯著提高（P＜0.01）， 達(dá)到（92±7） pg／mL左右， 但對(duì)干擾素-β 無明顯影響（P＞0.05）。

圖1 人參提取物對(duì)干擾素-α、 干擾素-β 分泌水平的影響Fig.1 Effects of Ginseng Radix et Rhizoma extract on interferon-α and interferon-β secretion levels

3.2 人參提取物對(duì)干擾素-α 的誘導(dǎo)途徑 圖2 顯示， 與空白組比較， 在THP-1、 293T 細(xì)胞中加入Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)劑poly （I ∶C） 后， 培養(yǎng)上清中干擾素-α 分泌水平均顯著提高（P＜0.01）； 人參提取物在THP-1 細(xì)胞中能顯著誘導(dǎo)其表達(dá)（P ＜0.01）， 但在293T 細(xì)胞中不明顯（P＞0.05）。

3.3 干擾素-α 下游基因表達(dá) 圖3 顯示， 與空白組比較， 人參提取物組BST-2、 APOBEC3G 表達(dá)顯著提高（P＜0.01）。

3.4 沉默干擾素-α 對(duì)BST-2、 APOBEC3G 表達(dá)的影響 圖4 顯示， 轉(zhuǎn)染靶向干擾素-α 的siRNA 后干擾素-α 表達(dá)顯著下降（P＜0.01）； 加入人參提取物后， BST-2、 APOBEC3G 表達(dá)顯著提高（P ＜0.01）； 但沉默干擾素-α 后， 即使再加入人參提取物兩者表達(dá)也無明顯提高（P＞0.05）。

4 討論

干擾素作為一種廣譜抗病毒劑， 并不能直接殺傷或抑制病毒， 而是通過一系列細(xì)胞信號(hào)通路產(chǎn)生多種抗病毒蛋白， 從而抑制多種病毒復(fù)制， 同時(shí)它還可增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞、 自然殺傷細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞活力， 起到免疫調(diào)節(jié)的作用， 并增強(qiáng)機(jī)體免疫力，目前正應(yīng)用于病毒性肝炎、 手足口病、 HPV 感染等多種疾病的治療中［12-15］。 研究表明， 多種中藥提取物具有提高機(jī)體內(nèi)源性干擾素表達(dá)的能力， 其中人參作為一種使用廣泛的中藥材， 被認(rèn)為具有提高機(jī)體免疫力的作用［16-17］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 人參提取物具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-α 作用， 但對(duì)干擾素-β 無誘導(dǎo)效果。

圖2 人參提取物對(duì)THP-1、 293T 細(xì)胞中干擾素-α 分泌水平的影響Fig.2 Effects of Ginseng Radix et Rhizoma extract on interfeton-α secretion levels in THP-1 and 293T cells

干擾素-α 主要通過Toll 樣受體及維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體途徑來進(jìn)行表達(dá)和分泌， 但在293T細(xì)胞中僅存在后一種途徑誘導(dǎo)方式［18］， 故通過該細(xì)胞可判斷誘導(dǎo)方式是否與維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體途徑相關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 人參提取物無法激活293T 細(xì)胞內(nèi)源性干擾素-α 分泌， 表明人參皂苷對(duì)干擾素-α 的誘導(dǎo)是通過Toll 樣受體途徑所致。

圖3 人參提取物對(duì)BST-2、 APOBEC3G 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Ginseng Radix et Rhizoma extract on BST-2 and APOBEC3G expressions

圖4 沉默干擾素-α 對(duì)BST-2、 APOBEC3G 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of silenced interferon-α on BST-2 and APOBEC3G expressions

BST-2、 APOBEC3G 是干擾素激活的2 種重要廣譜抗病毒因子［19-20］， 加入人參提取物后可提高兩者表達(dá)。 但對(duì)干擾素-α 實(shí)施基因沉默技術(shù)后兩者表達(dá)均受到抑制， 說明誘導(dǎo)得到的干擾素具備正常的激活抗病毒因子功能， 也提示人參提取物可能提高多種其他抗病毒因子表達(dá)， 并激活免疫細(xì)胞的活力，一定程度上揭示了人參提高免疫力的分子機(jī)制。