基于網絡藥理學及ADME 預測分析血脂靈片治療血脂異常的Q-marker

郭 銳， 蘇 瑾， 李志雄， 張懂懂， 國大亮?， 肖學鳳?

（1. 天津中醫藥大學中藥學院， 天津300193； 2. 中國中醫科學院中藥研究所， 北京100700）

血脂異常也稱為高脂血癥或脂代謝紊亂， 通常指血清中膽固醇、 甘油三酯、 低密度脂蛋白膽固醇過高， 高密度脂蛋白膽固醇過低， 是引起心腦血管疾病發生的重要危險因素之一［1-4］， 隨著經濟發展、 生活水平不斷提高， 人們患血脂異常的風險也在不斷增加［5］。 目前， 治療血脂異常的藥物以西藥為主， 如他汀類、 貝特類、 煙酸類， 雖然作用較強， 但服用后可能會出現肝損傷、 橫紋肌溶解、 皮膚過敏、 消化系統、 泌尿系統疾病等不良反應［6-7］。 血脂靈片被2015 年版《中國藥典》 收載，治療血脂異常療效確切， 而且經臨床驗證未見不良反應［8］， 它由制何首烏、 決明子、 澤瀉、 山楂4 味藥材組成， 具有化濁降脂、 潤腸通便功效， 用于痰濁阻滯型血脂異常［9-10］， 該方藥味雖少， 但組方精巧， 可降低甘油三酯和膽固醇， 上升低密度脂蛋白膽固醇， 具有很好的降脂作用［8］。

血脂靈片對血脂異常的調節作用是由方中多種有效成分通過不同機制發揮藥效所致， 但鮮有對其具體物質基礎和作用機制的研究， 2015 年版《中國藥典》 只將2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷、 大黃素作為其含有量測定的指標，但中藥復方臨床療效并不是一種或幾種成分作用的結果， 故藥典方法不足以從整體上控制該制劑質量。 因此， 本研究以劉昌孝院士提出的 “Qmarker” 概念為指導［11］， 結合網絡藥理學分析和ADME 預測， 篩選出血脂靈片治療血脂異常的Q-marker。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 化學成分來源 登錄整合藥理學平臺（TCM-IP， www.tcmip.cn）， 它是以中藥方劑數據庫、 中藥材數據庫、 中藥成分數據庫、 疾病癥狀靶標數據庫為支撐， 模型構建和生物信息技術為手段， 能有效揭示中藥藥效物質基礎及其分子機制的網絡版計算平臺［12］。 在整合藥理學平臺“信息設定” 模塊， 檢索中藥材“何首烏” “澤瀉” “山楂” “決明子”， 選擇檢索出的所有的化學成分，建立“血脂靈片” 化學成分庫。

1.1.2 藥物候選靶標來源 在整合藥理學平臺“中藥靶標預測” 模塊， 對所建立的“血脂靈片”化學成分庫中成分進行靶標預測， 選取血脂靈化學成分與DrugBank 藥物相似性分數大于0.6 的相似藥物， 取其對應靶標作為藥物候選靶標。

1.1.3 疾病候選靶標來源 整合藥理學平臺以Drugbank 數據庫為基礎， 藥物信息包括DrugID、Description、 Indication 等字段， 以英文詞為檢索詞， 從Drugbank 數據庫檢索相關FDA 認證藥物，然后通過藥物對應的靶標實現疾病靶標檢索。 在整合藥理學平臺的信息設定界面靶標檢索頁面， 選擇“Dyslipidemia” “Hyperlipidemia” 作為血脂異常疾病的關鍵詞進行檢索， 將檢索出的所有靶標作為疾病候選靶標。 同時在“HPO（human phenotype ontology）”（http： ／ ／human-phenotype-ontology.github.io）檢索“Dyslipidemia”， 將“Uniprot” （http： ／ ／www. uniprot. org） 上對應有人類基因組的基因添加為自定義靶標， 也作為疾病候選靶標。

1.1.4 構建網絡并分析 應用整合藥理學平臺“網絡構建與分析” 模塊， 構建“血脂靈片” 藥物靶標-血脂異常疾病靶標網絡， 篩選出血脂靈復方中治療血脂異常相關的成分， 并對這些成分所作用的相關靶標進行功能分析及通路分析。

1.2 ADME 預測 將血脂靈片中經網絡藥理學分析出 的 藥 效 成 分 通 過 “Chemspider” （http： ／ ／www.chemspider.com） 進行檢索， 并下載對應結構式， 導入“ACD／Percepta 軟件” （ACD／Labs， Toronto， Canada）， 應用“the passive intestinal permeability of Caco-2 module” “the PK explorer module”模塊預測透膜吸收和口服生物利用度， 篩選出Papp值大于7.0×10-6cm／s、 F 值大于66%的成分， 作為血脂靈片Q-marker。

2 結果

2.1 “血脂靈片” 治療血脂異常的核心靶標網絡分析 在整合藥理學平臺“信息設定” 模塊中檢索中藥材， 其中何首烏共收集到19 種成分， 主要為蒽醌類， 如大黃素甲醚、 大黃酚、 大黃素等， 以及二苯乙烯苷類及其葡萄糖苷類， 如2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、 2， 3， 5， 4′-四羥基-二苯乙烯-2， 3-二-O-β-D-葡萄糖苷等； 澤瀉共收集到31 種成分， 主要為三萜類， 如澤瀉醇A、 澤瀉醇B 等， 以及倍半萜類， 如澤瀉萜醇E、澤瀉萜醇F 等； 決明子共收集到27 種成分， 主要為蒽醌類， 如大黃酸、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素， 以及萘并-吡喃酮類， 如紅鐮霉素、 決明子苷；山楂共收集到30 種成分， 主要為黃酮及其苷類，如洋芹素、 木犀草素等， 黃酮醇及苷類， 如槲皮素、 山柰酚、 草質素等， 黃烷及其聚合物類， 如兒茶素、 表兒茶素等， 三萜類， 如熊果酸、 山楂酸，以及酚酸類和其他酸類， 如安息香酸、 沒食子酸、原兒茶酸、 綠原酸等。

在整合藥理學平臺“中藥靶標預測” 模塊中，將收集到的107 種成分與FDA 批準藥物的化學結構進行相似性評分， 將相似性分數大于0.6 的已知藥物對應靶標定義為藥物靶標， 結果共預測出8 662個靶標。 在整合藥理學平臺中， 搜索“Dyslipidemia” “Hyperlipidemia” 得到8 個疾病靶標，又通過HPO 與Uniprot 數據庫自定義添加171 個疾病靶標， 共收集到179 個。

在整合藥理學平臺“網絡構建與分析” 模塊中， 基于PPI 數據庫中靶標的相互作用， 構建血脂靈片藥物靶標與血脂異常疾病靶標之間相互作用網絡。 首先計算Degree 拓撲特征值， 取大于中位數的節點作為“hub” 節點， 然后根據節點間的PPI信息建立網絡。 再分別計算得到Degree、 Betweenness、 Closeness、 Coreness 拓撲特征值， 取四者均大于中位數的節點作為關鍵靶標， 共篩選出408個。 然后， 提取Degree 拓撲特征值排名前100 的靶標網絡（圖1）， 其中藥物靶標60 個， 疾病靶標15 個， 其他靶標28 個， 藥物和疾病共同靶標3個， 而且Degree 拓撲特征值的大小與圖中節點的面積大小呈正相關關系。

圖1 血脂靈片靶標網絡Fig.1 Targeted network of Xuezhiling Tablets

圖1 中3 個共同靶標是血脂靈片對血脂異常直接干預的靶標， 分別為CPT1A、 CPT2、 AR， 其中CPT1A 是線粒體脂肪酸氧化過程中起到關鍵作用的酶［13］， CPT2 是骨細胞或成骨細胞中負責脂肪酸氧化代謝的重要酶［14］， 兩者均在脂代謝環節中顯示出非常重要的作用［15］； AR 和肥胖、 胰島素抵抗、 瘦素抵抗等代謝性疾病有關［16］。 除了藥物和疾病共同靶標外， 與藥物靶標相關的疾病靶標還有12 個， 結合已有文獻， 推測血脂靈片間接干預的有 6 個， 分 別 為 HADHA、 AKT2、 NSDHL、DYRK1B、 PEX2、 ACAD8， 它們通過參與脂肪生成及 代 謝［17-18］、 膽 固 醇 合 成［19］、 甘 油 三 酯 代謝［20］、 甾醇去甲基化［21］、 促進葡萄糖-6-磷酸酶合成［22］等過程來調節血脂。

2.2 關鍵靶標網絡基因功能和代謝通路分析 在整合藥理學平臺“關鍵靶標分析” 模塊中， 通過GO 和KEGG 數據庫對408 個關鍵靶標進行基因功能分析， 根據P-Value 顯示前10 個條目， 見表1，可知基因功能主要涉及細胞質基質、 ATP 結合、藥物反應、 蛋白結合、 線粒體、 酶結合、 蛋白激酶活性、 蛋白磷酸化、 脂肪酸氧化、 蛋白酶活性等多個條目。

表1 血脂靈片關鍵靶標基因功能Tab.1 Gene functions of key targets for Xuezhiling Tablets

在整合藥理學平臺“關鍵靶標分析” 模塊中，通過GO 和KEGG 數據庫對408 個關鍵靶標進行信號通路分析， 見表2， 可知其主要集中在甲狀腺激素、 促性腺激素釋放激素、 雌激素、 催產素、 脂肪酸降解、 胰島素、 脂肪細胞因子等信號通路。 文獻報道， 血脂異常與內分泌有著密切關系， 甲狀腺激素能影響血脂代謝［23］； 體內促甲狀腺激素水平較高時， 高甘油三酯血癥的發生率較高［24］； 缺乏雌激素會導致脂質代謝紊亂， 而補充雌激素可部分糾正血脂異常［25］； 催產素表達下降可能是肥胖的病理機制之一［26］。

表2 血脂靈片關鍵靶標通路信息Tab.2 Pathway information of key targets for Xuezhiling Tablets

2.3 “成分-靶標-通路” 分析 在整合藥理學平臺“關鍵靶標分析” 模塊中， 提取P 值前30 的關鍵通路， 得到與其相關的核心靶標及血脂靈片藥效成分， 它們涉及多個方面， 如能量代謝通路， 甲狀腺激素、 促性腺激素釋放激素、 雌激素、 催產素等多個內分泌通路， 以及阿茲海默癥、 內分泌代謝疾病、 結直腸癌等疾病， 與這些通路相關的核心靶標有90 個， 血脂靈片藥效成分有95 種， 其中何首烏成分19 種， 決明子成分27 種， 共有成分5 種， 澤瀉成分26 種， 山楂成分28 種， 見圖2。 藥效成分對于血脂異常的干預主要集中在能量代謝和內分泌相關通路的靶標上， 95 種藥效成分中有75 種可能通過影響蛋白激酶及蛋白磷酸酶、 線粒體內膜上細胞色素C 氧化酶等來參與ATP 轉運合成， 從而影響線粒體活性等能量代謝過程； p-茴香醛、 亞油酸、 11-去氧澤瀉醇A 可能作用于腎上腺素、 前列腺素、 胰島素受體等相關內分泌過程， 從而起到調節血脂的作用。

圖2 血脂靈片“成分-靶標-通路” 網絡Fig.2 “Compounds-targets-pathways” network of Xuezhiling Tablets

2.4 藥效成分透膜吸收及生物利用度預測 大多數藥物的給藥途徑是口服， 藥物透膜吸收能力和口服生物利用度對其發揮藥效起到至關重要的作用［27］， 其中前者強弱通常由藥物在Caco-2 細胞中的轉運速率， 即表觀滲透系數 （Papp） 來評價，Papp＞7.0×10-6cm／s［28］的成分透膜能力較強； 后者強弱用F 來評價， ≤33%為低， 33% ～66%為中等，＞66%為高［29-30］。 通過“Chemspider” 下載到95 種關鍵成分的92 個對應結構式， 再應用“ACD／Percepta 軟件” 預測其Papp和F， 結果見表3， 可知有22 個滿足相關要求。

續表3

續表3

3 討論

隨著系統生物學和組學技術的發展， “網絡藥理學” 的概念在2007 年由Hopkins 等［31］首次提出， 是通過構建“疾病-基因-靶點-藥物” 網絡來更系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預機制［32］。中藥復方為多成分、 多靶點的協同作用機制， 可采用該方法初步揭示中藥復方的復雜的分子機制， 近年來廣泛應用于中醫藥領域研究［33-34］。

藥物在體內的吸收、 分布、 代謝、 排泄過程簡稱ADME， 可反映其藥效強弱［35］。 近年來隨著計算機技術、 組學技術、 高通量篩選技術的迅猛發展， 使本來在體內才能被準確獲取的ADME 相關指標可通過體外計算機輔助技術進行預測［36］， 既可達到在中藥復方中篩選藥效成分的目的， 又縮減了體內實驗檢測相關指標的時間。

中藥復方作用機制的傳統研究方法是將復方中藥所含化學成分進行分離后篩選活性成分， 但往往會忽視復方中各中藥之間的網絡化協同作用， 以及治療靶點的復雜性， 也難以闡釋其配伍的科學內涵［37］。 整合藥理學平臺結合大數據和模型計算，從人工智能、 數據挖掘、 網絡科學出發， 分析和預測中藥復方中藥效物質及其治療相關疾病的分子機制， 可為中藥質量評價、 分子機制闡釋、 新藥研發等提供強有力的技術支撐［38］。

本研究借助網絡藥理學平臺， 通過對血脂靈片治療血脂異常的分子機制進行分析， 又結合ADME預測尋找相關Q-marker。結果表明， 血脂靈片可作用于能量代謝相關靶標， 以及能量代謝、 內分泌等相關通路， 該預測與現有血脂異常相關文獻報道一致。 但22 種成分作為血脂靈片Q-marker 數量略多， 今后將進行體內ADME 和分子機制研究， 以確認最終的Q-marker。