側柏葉HPLC 指紋圖譜建立及4 種成分測定

宗珊珊， 蘇本正， 石典花，?， 戴衍朋， 孫立立， 張學順

（1. 山東中醫藥大學， 山東 濟南250355； 2. 山東省中醫藥研究院， 山東 濟南250014； 3. 山東中醫藥大學附屬醫院， 山東 濟南250011）

側柏葉來源于柏科植物側柏Platycladus orientalis （L.） Franco 的枝梢及葉， 多在夏、 秋兩季采收、 陰干， 其氣清香、 味苦澀， 歸肺、 肝、 脾經， 具有涼血止血、 化痰止咳、 生發烏發的功效，主要用于吐血、 衄血、 咯血、 便血、 崩漏下血、 肺熱咳嗽、 血熱脫發、 須發早白［1］， 化學成分主要有揮發油類［2-4］、 黃酮類［5-8］、 鞣質類［9-10］等， 主要為黃酮類［11］， 其中總黃酮具有抑制α-糖苷酶、 抗RBC 氧化損傷、 激活毛母細胞、 促進血液循環、養發、 生發作用； 楊梅苷具有收縮血管、 降血糖、抗氧化、 保肝、 利膽、 抗炎、 抗突變、 抗腫瘤［12］、鎮痛作用［13］； 槲皮苷具有止咳平喘、 抗炎、 抗過敏、 解痙、 強心、 降血壓、 擴張冠脈、 降血脂、 抗心律失常、 抗血小板聚集、 抗氧化、 抗腫瘤作用［14］； 穗花雙黃酮具有抗炎、 抗氧化、 抗微生物、抗腫瘤和神經保護作用， 可減輕腦損傷， 提高神經可塑性， 改善神經退行性疾病［15］。

目前， 《中國藥典》 及文獻報道側柏葉含有量測定的指標成分大多為槲皮苷［16］， 為進一步有效控制其質量， 本實驗在前期研究的基礎上建立了異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮的TLC 鑒別、 HPLC指紋圖譜及含有量測定的方法， 為進一步有效提升該藥材質量標準［17］提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler XS205DU 電子天平（十萬分之一， 瑞士Mettler-Tolodo 公司）； 超聲處理機（濟寧市中區魯超儀器廠）； 紫外儀（上海精科實業有限公司）； 水浴鍋（上海醫療器械五廠）； 鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）； 硅膠G 板（青島海洋化工廠）； UitiMate3000 高效液相色譜儀（配置UV 檢測器）、 Waters 2695 高效液相色譜儀（配置Waters 2996 DAD 檢測器） （美國Waters公司）。

1.2 試藥 楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮對照品均購于成都普瑞法科技開發有限公司（ 批 號 PRF8031443、 PRF8030703、 16022001、PRF7122043）。 10 批側柏葉為課題組于不同時間、地點采集后晾干凈制， 分別為濟南燕子山（1 號、5 號）、 濟南南部山區（2 號、 4 號）、 濟南佛慧山（3 號）、 臨沂東山（6 號）、 臨沂洪山（7 號）、 臨沂西北山（8） 號、 臨沂費縣（9 號） 和濟南章丘（10 號）， 經山東省中醫藥研究院林惠彬研究員鑒定為正品。 甲醇、 磷酸、 乙腈均為色譜純； 水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別 取側柏葉粉末1 g， 加70% 甲醇20 mL 超聲30 min， 過濾， 濾液蒸干， 加甲醇2 mL溶解， 作為供試品溶液。 取異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮對照品適量， 加甲醇制成質量濃度分別為0.1、 1、 0.1 mg／mL 的混合對照品溶液。 按照薄層色譜法（通則0502）， 吸取供試品、 對照品溶液各3 μL， 分別點于同一硅膠G 薄層板上， 以乙酸乙酯-甲醇-水 （100 ∶17 ∶13） 為展開劑， 展至約3 cm， 取出， 晾干， 再以甲苯（水飽和） -甲酸乙酯-甲酸（4.5 ∶4.5 ∶1） 為展開劑， 展開， 取出，晾干， 噴以1%三氯化鋁試液， 100 ℃加熱5 min，置紫外光燈（365 nm） 下檢視， 結果見圖1， 表明10 批側柏葉在與穗花雙黃酮、 槲皮苷、 異槲皮苷對照品色譜的相應位置上均顯相同顏色的熒光斑點。

2.2 側柏葉HPLC 指紋圖譜

圖1 10 批樣品TLC 圖譜（365 nm）Fig.1 TLC chromatogram of ten batches of samples（365 nm）

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 乙腈（A） -0.1%磷酸（B） 為流動相， 梯度洗脫（0～30 min， 10% ～20%A； 30～50 min， 20% ～40%A； 50 ～90 min， 40% ～70%A； 90～110 min， 70% ～100%A）； 柱溫30 ℃；體積流量1 mL／min； 檢測波長355 nm； 進樣量5 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 供試品溶液 取側柏葉粉末1 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加甲醇25 mL， 稱定質量，超聲處理30 min， 放冷， 甲醇補足減失的質量， 搖勻， 過濾， 取續濾液， 過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.2.2 對照品溶液 精密稱取楊梅苷、 槲皮苷、異槲皮苷、 穗花雙黃酮對照品適量， 加甲醇制成質量濃度分別為97.4、 10.03、 120、 13.34 μg／mL 的對照品溶液。

2.2.3 方法學驗證

2.2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液（3 號）， 在“2.2.1” 項色譜條件下連續進樣6 次， 測得各色譜峰相對保留時間RSD＜0.1%， 相對峰面積RSD＜5%， 表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 穩定性試驗 取供試品溶液（3 號）， 在“2.2.1” 項色譜條件下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h進樣， 測得各色譜峰相對保留時間RSD＜0.13%，相對峰面積RSD＜5%， 表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.3.3 重復性試驗 取3 號樣品6 份， 按“2.2.2.1” 項 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液， 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣， 測得各色譜峰相對保留時間RSD＜0.1%， 相對峰面積RSD＜5%， 表明該方法重復性良好。

2.2.4 指紋圖譜建立

2.2.4.1 色譜峰歸屬 按“2.2.2.1” 項下方法制備10 批供試品溶液， 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣， 記錄峰面積， 將指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0 版” 進行分析，結果見圖2， 標定了18 個共有峰， 見圖3。 與對照品色譜圖（圖4） 保留時間比較， 確定第3、 4、6、 12 號色譜峰分別為楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮。 圖3 中， 6 號槲皮苷峰前后無雜質峰干擾， 分離度較高， 峰形較好， 峰面積相對穩定， 故將其確定為參照峰， 各特征峰相對保留時間應在規定值的±5%之內。s

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of ten batches of sample

2.2.4.2 相似度 將10 批樣品指紋圖譜數據導入相似度評價軟件， 生成對照圖譜， 經多點校正、 色譜峰匹配計算相似度， 結果見表1。 由表可知， 10批樣品指紋圖譜相似度均在0.98 以上， 表明不同時間、 地點采集的側柏葉的質量差異不大。

圖3 10 批樣品共有峰Fig.3 Common peaks of ten batches of samples

圖4 對照品色譜峰Fig.4 Chromatographic peaks of reference substances

表1 10 批樣品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

2.3 側柏葉含有量測定

2.3.1 色譜條件 Phenomenex Gemini 色譜柱（250 mm×4.60 mm， 5 μm）； 乙腈（A） -0.1%磷酸（B） 為流動相， 梯度洗脫（0～20 min， 17%A；20～60 min， 17% ～50%A）； 柱溫35 ℃； 體積流量1 mL／min； 檢測波長355 nm； 進樣量10 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 供試品溶液 取側柏葉粉末1 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加甲醇25 mL， 稱定質量，超聲處理30 min， 放冷， 甲醇補足減失的質量， 搖勻， 過濾， 取續濾液， 0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.2.2 對照品溶液 精密稱取楊梅苷、 槲皮苷、異槲皮苷、 穗花雙黃酮對照品適量， 加甲醇制成質量濃度分別為0.974、 0.100、 1.20、 0.133 mg／mL的對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 系統適應性試驗 按照高效液相色譜法（2015 版 《中 國 藥 典》 四 部 通 則0512）， 在“2.3.1” 項色譜條件下精密吸取對照品、 供試品溶液各10 μL 進樣。結果， 對照品溶液與供試品溶液在相同保留時間有相應峰形， 峰形對稱， 無拖尾現象， 見圖5～6。

2.3.3.2 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1 mL， 置10 mL 量瓶中， 甲醇溶解并定容至刻度，搖勻， 精密吸取0、 2、 4、 6、 8、 10、 15 μL， 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣， 以進樣量為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸， 得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮回歸方程分別為Y ＝33.394X ＋0.060 4（R2＝0.999 7）、 Y ＝0.027 4X＋0.053 6（R2＝0.995 3）、 Y ＝0.029 8X-0.055 1 （R2＝0.999 8）、 Y ＝4.622 9X ＋0.188 3（R2＝0.999 9）， 分別在0 ～1.461 0、 0 ～150.45、0～1 800、 0～50.1 ng 范圍內線性關系良好。

圖5 對照品HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of reference substances

圖6 側柏葉HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of Platycladi Cacumen

2.3.3.3 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（3號樣品）， 在“2.3.1” 項色譜條件下連續進樣6次， 每次10 μL， 測得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮峰面積RSD 分別為0.16%、0.14%、 0.09%、 0.07%， 表明儀器精密度良好。

2.3.3.4 穩定性試驗 精密吸取3 號樣品供試品溶液， 在“2.3.1” 項色譜條件下于0、 2、 4、 6、8、 10、 12、 24 h 進樣， 測得楊梅苷、 異槲皮苷、槲皮苷、 穗花雙黃酮峰面積RSD 分別為0.48%、0.56%、 0.59%、 0.62%， 表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.3.5 重復性試驗 按“2.3.2.1” 項下方法平行制備供試品溶液5 份 （3 號樣品）， 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣， 測得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮含有量RSD 分別為1.92%、 1.54%、 1.61%、 1.84%， 表明該方法重復性良好。

2.3.3.6 加樣回收率試驗 取含有量已知的3 號樣品0.5 g， 精密稱定5 份， 置于具塞錐形瓶中，分別加入1 mL 適宜濃度的上述4 種對照品溶液，再加入甲醇21 mL， 稱定質量， 超聲30 min， 放冷， 甲醇補足減失的質量， 過濾， 濾液過0.45 μm微孔濾膜， 得供試品溶液， 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣， 測得楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、 穗花雙黃酮的平均加樣回收率分別為101.77%、107.73%、 101.75%、 105.95%， RSD 分 別 為2.93%、 1.50%、 2.74%、 1.35%。

2.3.3.7 樣品含有量測定 取10 批樣品， 按“2.3.2.1” 項 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液， 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣， 計算含有量， 結果見表2。

3 討論與結論

本實驗在TLC 鑒別中通過展開系統的優選，最終確定采用二次展開， 此時槲皮苷、 異槲皮苷、穗花雙黃酮3 種成分均分離完全、 斑點清晰， 故可將其作為側柏葉藥材或飲片TLC 鑒別的指標性成分。

然后， 考察了甲醇-水、 乙腈-水、 甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等系統， 結果表明乙腈-磷酸系統中雜質峰干擾較少， 分離度較高， 峰形較好， 峰面積較穩定， 故選用其進行梯度洗脫。 再建立了側柏葉HPLC 特征指紋圖譜， 并進行方法學考察， 在18個共有特征峰中辨識出槲皮苷、 異槲皮苷、 楊梅苷、 穗花雙黃酮， 其中槲皮苷峰無雜質峰干擾， 分離度高， 峰形良好， 峰面積穩定， 故確定其為參照峰。

表2 各成分含有量測定結果（mg／g， n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝2）

含有量測定結果表明， 10 批樣品中4 種黃酮類成分存在一定差異， 這可能與產地、 采收時間及生長年限有關。 結合2015 年版《中國藥典》 側柏葉項下槲皮苷含有量限度， 初步將其中4 種黃酮類成分的含有量限度設定為平均值下浮50% （楊梅苷不得少于0.10%， 異槲皮苷不得少于0.01%，槲皮苷不得少于0.20%， 穗花雙黃酮不得少于0.03%）。

綜上所述， 本實驗建立的側柏葉TLC 鑒別、HPLC 指紋圖譜及楊梅苷、 異槲皮苷、 槲皮苷、穗花雙黃酮含有量測定方法均簡便可行， 可用于控制該藥材質量， 進而保障其臨床療效。 今后，將繼續研究在指紋圖譜中或建立一測多評法測定上述成分含有量， 以期在提高標準的同時節省成本和資源。