補骨脂酒制工藝的優化

葉斌斌， 敖楠楠， 姜明月， 曲 揚， 鄭 彧

（遼寧中醫藥大學， 遼寧 大連116600）

補骨脂別名和蘭莧、 胡韭子， 為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果實， 其性溫、 味辛， 具有補腎助陽、 溫中止瀉、 納氣平喘之功效［1］。 但補骨脂溫燥之性易傷陰助火， 故臨床用藥需對其進行炮制， 炮制方法始載于《雷公炮炙論》， 有雷公法、 酒浸炒、 清炒、 鹽炙、蒸法等［2］， 目前其炮制工藝以2015 版《中國藥典》 中所規定的鹽炙法為主， 關于炮制前后成分種類及含有量變化的研究也大多為鹽炙品［3-4］。

然而， 研究表明補骨脂經鹽炙后香豆素、 黃酮、 單萜酚類成分均呈上升趨勢［5］， 而補骨脂酚具有肝毒性和腎毒性［6-7］， 可能會對臨床用藥的安全性產生影響。 補骨脂酒制品古來有之， 但雷公制因其操作繁復性不利于工業化大規模生產， 課題組前期考察酒制法與雷公制所得指紋圖譜［8］， 發現兩者有效成分種類及含有量差異較小， 本實驗通過Box-Behnken 設計優化補骨脂酒制工藝， 以期完善該工藝， 并為后續相關炮制機理研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 9030A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）； LC-10AT 高效液相色譜儀 （日本島津公司）； DFT-50 手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）； KQ2200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； AE240 電子分析天平（十萬分之一， 瑞士Mettler-Toledo 公司）； HC-2518R 高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 補骨脂（產地安徽， 批號20160859） 及補骨脂素（批號140706）、 異補骨脂素（批號150422）、 補骨脂甲素（批號140904）、 補骨脂乙素（批號140515）、 補骨脂寧（批號150804）、 補骨脂定（批號140716）、 補骨脂酚（批號 wkq16061501）、 補 骨 脂 二 氫 黃 酮 甲 醚 （批 號150305） 對照品均由成都普菲德生物技術有限公司提供，含有量均≥98%。 乙腈、 甲醇為色譜純， 由美國Thermo Fisher Scientific 公司提供； 水為超純水， 由杭州娃哈哈集團有限公司提供； 龍泉黃酒 （產品標準號GB／T 13662-2008） 由大連長興島酒業有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 成分含有量測定（HPLC 法）

2.1.1 色譜條件 J＆K Chemical Ltd 色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm， S／N SJA702-05）； 流動相乙腈-水， 梯度洗脫（0～10 min， 5% ～45%乙腈； 10～45 min， 45% ～70%乙腈； 45～60 min， 70% ～100% 乙腈； 60 ～70 min， 100% 乙腈）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長220、250 nm； 進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量， 甲醇配制成一定質量濃度貯備液， 精密吸取適量置于10 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 即得含補骨脂素0.18 mg／mL、 異補骨脂素0.09 mg／mL、 補骨脂甲素0.12 mg／mL、 補骨脂乙素0.222 mg／mL、 補 骨 脂 寧0.036 mg／mL、 補 骨 脂 定0.128 mg／mL、 補骨脂酚1.051 mg／mL.、 補骨脂二氫黃酮甲醚0.154 mg／mL 的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末（過3 號篩） 約0.2 g， 置于25 mL 量瓶中， 70%乙醇超聲1 h， 放冷， 定容至刻度， 搖勻后靜置， 上清液離心， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 取續濾液， 即得。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 取“2.1.2” 項下對照品溶液， 稀釋0、 1.25、 5／3、 2.5、 5、 10 倍， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣10 μL 測定。 以溶液質量濃度為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸， 結果見表1， 可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.2.2 精密度試驗 取同一份供試品溶液， 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次， 測得各成分峰面積RSD 為0.92% ～1.65%， 表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 精密稱取藥材6 份， 按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定， 測得各成分峰面積RSD 為1.83% ～2.36%， 表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液， 在“2.1.1”項色譜條件下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 進樣測定， 測得各成分峰面積RSD 為1.57% ～2.19%， 表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱定含有量已知的藥材粉末6 份， 每份約0.1 g， 精密加入各對照品， 按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次， 測得各成分平均加樣回收率為97.23% ～101.52%， RSD 為0.99% ～2.06%。

2.3 酒制工藝優化 在預實驗基礎上， 選擇烘制溫度（A）、 加熱時間（B）、 黃酒量（C） 作為影響因素， 采用Box-Behnken 設計確定三因素三水平， 因素水平見表2。 再稱取17 份藥材， 每份10 g， 以補骨脂素（W1）、 異補骨脂素（W2）、 補骨脂甲素（W3）、 補骨脂乙素（W4）、 補骨脂寧（W5）、 補骨脂定（W6）、 補骨脂酚（W7）、 補骨脂二氫黃酮甲醚（W8） 含有量為影響因素， 采用加權評分法優化酒制工藝［9］（設定滿分為100 分， 由于補骨脂素、 異補骨脂素為主要有效成分［10］， 故其權重系數均設定為0.2，而其他6 種成分均設定為0.1）， 計算綜合評分 （Y，0.2 W1／W1max×100 ＋0.2W2／W2max×100 ＋0.1W3／W3max×100 ＋0.1W4／W4max×100 ＋0.1W5／W5max×100 ＋0.1W6／W6max×100 ＋0.1W7／W7max×100＋0.1W8／W8max×100）， 結果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設計及結果

通過Design Expert 8.0.6.1 軟件進行多元回歸分析，得到 方程為Y ＝86.44 ＋0.98A-0.85B-0.62C ＋0.48AB-1.27AC-0.07BC-1.25A2-1.63B2-2.33C2（R2＝0.914 6），方差分析見表4。 由表可知， 模型P＜0.05， 可用于預測；因素A （烘制溫度）、 B （加熱時間） 對綜合評分影響顯著（P＜0.05）， 而C 影響不顯著（P＞0.05）。 響應面分析見圖1。

表4 方差分析

2.4 驗證試驗 根據回歸方程， 確定最佳酒制工藝為每100 g 補骨脂中加入17.36 g 黃酒， 169.25 ℃下加熱烘制9.08 min， 為了便于工業化操作， 將其修正為每100 g 補骨脂中加入17 g 黃酒， 169 ℃下加熱烘制9 min。 然后， 取3份藥材， 每份100 g， 按照上述優化工藝進行驗證試驗， 測得補骨脂素、 異補骨脂素、 補骨脂甲素、 補骨脂乙素、 補骨脂寧、 補骨脂定、 補骨脂酚、 補骨脂二氫黃酮甲醚含有量分別為0.381%、 0.395%、 0.470%、 0.877%、 0.344%、0.626%、 8.041%、 0.915%， 綜合評分86.21， 與預測值86.84 相當， 表明該工藝穩定可行。

圖1 各因素響應面圖

3 討論

目前， 補骨脂炮制工藝考察經常僅以補骨脂素、 異補骨脂素含有量作為評價指標［11］， 而本實驗選擇補骨脂素、異補骨脂素、 補骨脂甲素、 補骨脂乙素、 補骨脂定、 補骨脂寧、 補骨脂酚、 補骨脂二氫黃酮甲醚含有量的綜合評分，可避免單一成分的片面性， 為相關生產和臨床應用提供參考。 同時， 還采用Box-Behnken 設計［12］優化酒制工藝， 該方法選擇實驗體系的目標響應值作為單個或多個實驗因素的函數， 并在整個區域上找到考察因素和響應值之間的函數表達式， 與正交設計、 均勻設計比較更接近客觀實際，而且兼顧了多個影響因素及因素之間的相互作用， 使試驗次數較少的同時獲得更精確的參數。

補骨脂生品中， 補骨脂素、 異補骨脂素、 補骨脂甲素、補骨脂乙素、 補骨脂寧、 補骨脂定、 補骨脂酚、 補骨脂二氫黃酮甲醚含有量分別為0.403%、 0.410%、 0.499%、0.882%、 0.312%、 0.546%、 8.759%、 0.851%， 而經優化工藝所得酒制品中補骨脂素、 異補骨脂素含有量略微下降，可能是由于酒制過程中的高溫使香豆素類成分開環所致；補骨脂酚含有量呈下降趨勢， 可能是由于該成分屬于單萜酚類化合物， 具有揮發性， 在加熱過程中隨水蒸氣一同蒸發所致， 并且它具有肝毒性和腎毒性［6-7］， 其含有量下降表明酒制可能具有減毒功效； 黃酮類成分含有量呈上升趨勢，前期研究表明該現象可能是補骨脂在炮制過程中種皮破碎，從而引起藥材溶出率增大［13］， 但本實驗在制備供試品時以藥材細粉為原料， 避免了因藥材組織結構松散而引起含有量變化的干擾， 故其含有量變化可能是藥材中各成分之間發生轉化， 具體機制還有待進一步研究。

今后， 本實驗將考察補骨脂生品及不同炮制品對腺嘌呤致腎陽虛小鼠的治療作用， 用于明確藥材炮制前后的藥效學變化， 為其量效關系研究奠定基礎。