姜制附子對大鼠機體熱性的影響

童恒力， 鐘凌云， 祝 婧

（江西中醫藥大學， 江西 南昌330004）

宋代《博濟方》 中有記載姜制附子的方法， 云“去皮臍， 生切作四塊， 用生姜半觔， 用水一碗同煮附子， 汁盡為度， 取附子焙干為末”； 《類編朱氏極驗醫方》 也提出“大附子， 慎火， 炮裂去皮， 切作拾片， 用生姜， 米泔淹一宿， 去姜， 薄切焙干”； 樟幫的臨江片采用生姜片拌蒸、 經米泔水漂洗過的附子， 而建昌幫的陰附片則使用生姜汁悶潤附子后蒸制。 附子性大熱、 有毒， 傳統中醫理論有“附子無姜不熱” 的說法， 而且有研究表明姜辣素對其毒性成分有抑制作用［1］， 故姜制附子有一定的理論基礎。

舌診是中醫的一種辨證方法， 可通過舌像辨別機體的寒熱虛實狀態， 以及氣血津液的盛衰， 現代科學也證實舌像變化可反映機體的健康狀態［2］， 目前提倡通過實驗過程中動物所表現出的宏觀表征來辨析中醫證候， 從而能更好地從中醫思路出發開展研究［3］。

Na＋-K＋-ATP 酶是一種體內廣泛存在的細胞膜蛋白， 其消耗很大一部分機體新陳代謝的能量來維持細胞內外離子平衡， 以及調節一些能量物質的運輸［4-5］； 前列腺素E2（PGE2） 是具有多種生理功能的活性物質， 其與EP3 受體結合是發揮致熱作用的基礎［6］； 腎上腺素（EPI） 能使機體呼吸加深加快（攝入大量氧氣）， 加速心跳與血液流動，為機體活動提供更多能量。 本實驗通過上述能量相關指標研究姜制對附子藥性變化的影響， 為臨床使用相關飲片提供一定參考。

1 材料

1.1 動物 SD 雄性大鼠， 體質量（200±20） g， 共84 只（其中28 只作預實驗用）， 購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司， 動物生產許可證號SCXK （魯） 20140007， 檢疫后備用。

1.2 藥材 鹽附子購自四川江油， 生姜購自廣東高明區，母姜購自四川犍為， 均由江西中醫藥大學中藥鑒定學教研室葛菲教授鑒定為正品。

1.3 姜制品

1.3.1 干姜片 犍為母姜切片（約0.3 cm 厚）， 低溫烘干， 即得。

1.3.2 生姜榨汁 取生姜洗凈切片， 加水反復壓榨4 次，合并， 過濾， 低溫濃縮。

1.3.3 生姜煎汁 取生姜洗凈切片， 加水煎煮3 次， 合并汁液， 過濾， 濃縮。

1.3.4 干姜煎汁 取干姜煎煮3 次， 合并汁液， 過濾，濃縮。

1.3.5 干姜片（生姜片） 拌蒸附子 將附子洗去鹽分，冷水漂洗數天并經常換水， 除去外皮， 切片， 米泔水漂洗數天， 取適量生姜片（干姜片） 拌勻， 置于蒸籠中蒸制，低溫烘干， 即得。

1.3.6 干姜煎汁（生姜煎汁、 生姜榨汁） 拌蒸附子 將附子洗去鹽分， 冷水漂洗數天并經常換水， 烘干， 加入適量干姜煎汁（生姜煎汁、 生姜榨汁）， 悶潤后置于蒸籠中蒸制， 切成薄片， 低溫烘干， 即得。

1.4 煎劑 生附子加10 倍量水浸泡45 min， 沸騰后第1次煎煮30 min， 第2 次加6 倍量水， 沸騰后煎煮30 min，紗布濾過， 合并煎液， 減壓濃縮后置于冰箱冷藏保存備用。同法制備姜制附子煎劑。

1.5 試藥及儀器 25%戊二醛溶液（國藥集團化學試劑有限公司， 100 mL， 批號20131217）； 水合氯醛（上海凌峰化學試劑有限公司， 250 g， 批號20150703）； 超微量ATP（Na＋K＋） 測 試 盒 （2-1、 2-2） （100 T／50 樣， 批 號20170419）、 考馬斯亮蘭 （100 T／96 樣， 批號20170421，南京建成生物工程研究所）； 大鼠腎上腺素（EPI， 批號CSB-E08678r）、 大 鼠 前 列 腺 素E2（PGE2， 批 號 CSBE07967r） ELISA 試劑盒（96T， 武漢華美生物工程有限公司）。 電子天平（型號YB502N， 上海海康電子儀器廠）；掃描電子顯微鏡（型號S-570， 日本日立公司）； 紫外可見分光光度計（型號UV8000S， 上海元析儀器有限公司） ；旋轉蒸發儀（型號RE52CS， 上海亞榮生化儀器廠）； 循環水式真空泵（型號SHZ-DⅢ， 鞏義市予華儀器有限責任公司）； 代謝籠。

2 方法

2.1 分組及給藥 將56 只大鼠隨機分為7 組， 每組8 只，分別為空白組、 干姜煮汁制附子組、 生姜煮汁制附子組、生姜榨汁制附子組、 干姜片拌蒸制附子組、 生姜片拌蒸制附子組、 生附子組， 各組給藥劑量均為1.54 g 生藥／kg（按2015 版《中國藥典》 成人臨床最大用藥量60 kg 體質量換算）， 每天灌胃給藥1 次， 灌胃量為15 mL／kg 體質量，連續31 d， 其間不間斷提供飼料和水。

2.2 熱性證狀指標檢測

2.2.1 舌像 各組大鼠在實驗第31 天給藥1 h 后處死， 鑷子頂開大鼠上下頜暴露出舌體， 輕拉出舌體， 同時于舌體根部用手術剪剪斷， 迅速用生理鹽水清洗舌體， 將舌體固定于2.5%戊二醛溶液中備用。 從固定液中取出大鼠舌體，0.1 mol／L 磷酸鹽緩沖液漂洗干凈后， 1% 鋨酸固定至少2 h， 50%、 70%、 90%、 95% 乙醇逐步進行脫水處理， 再換成醋酸異戊酯， 每次浸泡約15 min， 干燥舌體后， 掃描電鏡觀察微觀結構。

2.2.2 宏觀體征 各組大鼠預置于代謝籠內飼養3 d 以適應環境， 首次灌胃給藥前稱定體質量， 肛溫計測量肛溫，從給藥當天起每5 d 記錄1 次肛溫、 飲食量、 飲水量， 再稱定體質量， 共觀察31 d。

2.2.3 肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性 末次給藥1 h 后， 大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉， 劑量0.3 mL／kg 體質量，開腹分離肝臟周遭韌帶， 迅速剪取活體肝組織， 立即用磷酸緩沖鹽溶液清洗， 錫箔紙包裹后置于液氮中保存， 再轉移至-80 ℃冰箱中。 精密稱取肝組織1 g， 冰浴下加入9 mL生理鹽水勻漿， 均勻勻漿后3 000 r／min 離心約10 min， 取上清液， 加入9 倍量生理鹽水制成1%肝組織勻漿液， 按照考馬斯亮藍試劑盒及超微量Na＋-K＋-ATP 酶測試盒說明書進行操作。

2.2.4 血清EPI、 PGE2水平 末次給藥1 h 后， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 劑量0.3 mL／kg 體質量， 備皮，開腹， 腹 主 動 脈 取 血， 凝 固 （4 ℃） 60 min 后 離 心（3 000 r／min） 5 min 得到血清， 置于-20 ℃冰箱中保存備用， 按照EPI、 PGE2血清試劑盒說明書進行操作。

2.3 統計學分析 通過SPSS 19.0 統計軟件進行處理， 計量資料以（±s）表示， 不滿足統計學要求的數據進行轉換，組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 舌像

3.1.1 姜制對大鼠舌體絲狀乳頭數目的影響 與空白組比較， 各姜制附子組大鼠舌體絲狀乳頭數目均有不同程度的增加， 以生姜煮汁制附子組更顯著（P＜0.05）。 見表1。

表1 姜制對大鼠舌體絲狀乳頭數目的影響（±s， n＝8）

表1 姜制對大鼠舌體絲狀乳頭數目的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05

組別 絲狀乳頭數目空白組 60.63±10.68生附子組 66.25±10.26生姜榨汁制附子組 67.38±22.51生姜煮汁制附子組 80.13±20.83?生姜片制附子組 79.00±26.54干姜煮汁制附子組 67.88±18.47干姜片制附子組 61.25±12.46

3.1.2 姜制對大鼠舌體絲狀乳頭角質化程度的影響 與空白組比較， 生附子組大鼠舌體絲狀乳頭基部更粗糙， 但角質變厚， 剝落現象不明顯； 生姜制附子組大鼠舌體絲狀乳頭基部角質化程度明顯， 角質層厚， 裂紋及脫落嚴重； 干姜制附子組大鼠絲狀乳頭表面凹凸不平， 角質層厚且粗糙，脫落現象不明顯。 見圖1。

3.1.3 姜制對大鼠舌體蕈狀乳頭角質化程度的影響 與空白組比較， 生附子組大鼠蕈狀乳頭角質層更厚； 與空白組、生附子組比較， 各姜制附子組大鼠蕈狀乳頭周遭有大量角質層包裹， 而且角質層厚， 裂紋多， 有剝落痕跡。 見圖2。

3.2 宏觀體征

3.2.1 體質量 各組大鼠體質量均無明顯變化。

3.2.2 肛溫 除空白組、 生姜片制附子組外， 各組大鼠肛溫在給藥后出現下降趨勢， 在第6 ～11 天開始回升或上升變快， 在第16 天左右開始下降， 在第21 天后又開始上升，從第26 天起與空白組相比， 除生附子組、 生姜榨汁制附子組外均有顯著差異（P＜0.05）。 見圖3。

3.2.3 飲食量 各組大鼠飲食量隨飼養時間延長均有略微增多趨勢， 但無明顯變化。

3.2.4 飲水量 各組大鼠飲水量隨飼養時間延長逐漸增加， 從第26 天起開始超過空白組， 并隨時間推移出現顯著差異（P＜0.05）。 見圖4。

3.3 肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性 與空白組比較， 生附子組、 干姜煮汁制附子組大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性顯著降低（P＜0.01）； 與生附子組比較， 各姜制附子組其活性均顯著升高（P＜0.01）。 見表2。

圖1 姜制對大鼠舌體絲狀乳頭角質化程度的影響（×1 000）

圖2 姜制對大鼠舌體蕈狀乳頭角質化程度的影響（×1 000）

圖3 各組大鼠肛溫變化

表2 姜制對大鼠肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性的影響（±s，n＝8）

表2 姜制對大鼠肝組織Na＋-K＋-ATP 酶活性的影響（±s，n＝8）

組別 Na＋-K＋-ATP 酶活性／（U·mg prot-1）空白組 4.67±0.51＃＃生附子組 2.72±0.29??生姜榨汁制附子組 4.12±0.68＃＃生姜煮汁制附子組 4.30±0.59＃＃生姜片制附子組 4.60±0.36＃＃干姜煮汁制附子組 4.09±0.61＃＃??干姜片制附子組 4.76±0.72＃＃

圖4 各組大鼠飲水量變化

注：與空白組比較，??P＜0.01；與生附子組比較，＃＃P＜0.01 3.4 血清EPI、 PGE2水平 由于血清EPI、 PGE2水平指標個體差異較大， 為了避免數據統計無意義， 在數據處理時對其進行對數轉換以符合統計學要求。 與空白組比較， 除干姜片制附子組兩者水平顯著降低（P＜0.05） 外， 各組均有升高趨勢， 以生姜榨汁制附子組更顯著（P＜0.05）。 見表3。

4 討論

動物模型是實驗研究的基礎［7］， 大鼠與人類相似， 具備中醫診斷和證候的變化， 并且模型易于推廣［8］。 中醫看病注重舌苔變化， 舌與臟腑有著密切聯系， 可通過舌像來了解機體狀態本質， 其中體質量、 肛溫、 飲食量、 飲水量能最客觀直接地反映出機體的形體及生理狀態， 能較好地符合中醫對人體問診的過程， 故選擇上述指標作為外在表征。 Na＋-K＋-ATP 酶存在于細胞膜上， 維持著細胞靜息電位， 與細胞攝入能量營養物質、 排出代謝產物密切相關，可反映細胞活動狀態［9］； 腎上腺素是一種能使人新陳代謝大大加速的激素和神經傳遞物質， 可增加小血管阻力， 強化心肌收縮和耗氧， 增加機體中央血流量［10］； 前列腺素E2可雙向調節血壓［11］， 并對人體免疫系統有著復雜的調節作用［6］， 同時在人體致熱過程中發揮重要作用， 故選擇上述指標作為內在表征。

表3 姜制對大鼠血清EPI、 PGE2 水平的影響（±s， n＝8）

表3 姜制對大鼠血清EPI、 PGE2 水平的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與生附子組比較，＃P＜0.05

組別 EPI PGE2空白組 1.01±0.25 0.89±0.19生附子組 1.38±0.47 1.27±0.44生姜榨汁制附子組 1.43±0.58? 1.35±0.58?生姜煮汁制附子組 1.11±0.49 1.00±0.47生姜片制附子組 1.10±0.35 1.02±0.37干姜煮汁制附子組 1.20±0.35 1.14±0.39干姜片制附子組 0.87±0.26＃ 0.77±0.32＃

中醫熱癥有舌體發紅、 舌苔厚且黃、 口渴、 體溫不穩等癥狀［12］， 舌診是中醫觀察疾病的基本手段之一［13］， 《皇帝內經》 中即有記載與理論， 現有研究也認為舌有豐富的血管與神經分布， 對機體健康狀態有著靈敏直接的反應［14］。 本實驗發現， 各姜制附子組大鼠舌乳頭均有數目增多、 角質層明顯增厚的現象， 導致舌苔發黃發厚， 呈現熱證舌像， 表明生附子及姜制附子均有令機體產生熱性證狀的趨勢， 同時各組大鼠肛溫變化不定， 飲水量在給藥后期也與空白組出現顯著差異， 這些體征指標也均符合中醫臨床熱癥的體征表現， 均對機體有肯定的致熱作用。 另外，大鼠體質量、 飲食量無明顯變化， 可能原因是給藥量不高，在臨床人使用劑量范圍內換算對大鼠的熱性影響比較緩和，具體有待進一步研究。

同時， 生附子組大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性與其他各姜制附子組比較顯著偏低， 導致細胞能量生成和消耗出現障礙， 使得心肌細胞紊亂， 引起心臟疾病發生［9］， 可能也是附子毒性發揮的機制之一； 各種姜制附子組大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性與生附子組比較均有顯著提高， 表明姜制可緩解其毒性。

腎上腺素（EPI） 可增加機體對能量的消耗， 而前列腺素E2（PGE2） 在機體致熱過程中發揮重要作用［6］。 本實驗發現， 除干姜片制附子組兩者水平與空白組比較顯著降低外， 各組均有不同程度的升高趨勢， 以生姜榨汁制附子組更顯著， 表明姜制附子可在一定程度上提高大鼠機體產熱和能量代謝水平， 尤其是生姜榨汁制附子， 其原因可能是未經加熱處理過的姜汁中某些成分可與附子成分發揮協同作用， 具體還有待進一步研究。

通過考察大鼠體內、 外熱性證狀指標顯示， 各姜制附子組中生姜榨汁制附子對機體熱性影響最為突出。 生姜榨汁是唯一在附子蒸煮加工前使用未經加熱處理的姜產品長時間潤制藥材的輔料， 由于姜在加熱后所含揮發油、 姜辣素、 游離氨基酸微量元素等成分的含有量均降低［15］， 而且中醫理論認為干姜汁主制藥物寒性， 鮮姜汁緩和藥物毒副作用， 同時生姜解表， 干姜溫里［16］， 故附子炮制后的藥性變化可能與鮮姜汁中含有量較高的成分有更大關聯。

綜上所述， 本實驗通過熱性的機體內、 外表征指標，考察了基于樟幫、 建昌幫炮制的不同姜輔料所制備附子飲片對大鼠機體的影響， 發現各種姜輔料均可對附子產生一定解毒作用， 并在一定程度上加強附子熱性， 以生姜榨汁制附子最顯著。 今后， 將開展不同姜輔料和姜制附子成分分析及動物代謝組學、 物質能量代謝等方面的考察， 以期對其藥性和藥效進行探討。