多核銅槲皮素配合物對DNA的作用研究

王繼群， 魏然茹， 宋 月， 劉俊杰， 程秀珍， 李 婧*

(1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農墾大學理學院，黑龍江 大慶 163319)

槲皮素金屬配合物具有較強生理活性，如，抗炎、抗病毒、抗腫瘤等[1-3]。其生理活性通常強于槲皮素單體，一方面，由于配合物溶解性很大程度改善了槲皮素本身的溶解性，另一方面，金屬離子參與作用具有加強生物活性的作用[4-5]。槲皮素金屬配合物抗腫瘤活性研究是熱門課題之一，作用機理[6]其一為金屬配合物可以插到DNA的堿基對，與DNA產生強烈的鍵合作用，從而影響DNA分子的內部構型，抑制了分子的遺傳與復制。配合物與DNA作用主要有3種形式：非共價鍵作用(靜電結合、插入結合和溝區結合)、共價結合、剪切作用。配合物通常采用插入和部分插入的模式與DNA作用，在一定濃度下展現裂解DNA的作用[7]。

本課題組研究發現，苯甲酸銅和新戊酸銅與槲皮素反應，具有雙齒配位性能的新戊酸根和苯甲酸根，參與槲皮素銅配合物的形成，生成多種形式的配合物，推測結構如圖1所示[8]：配合物1由新戊酸銅或苯甲酸銅與槲皮素反應得到，其結構與文獻報道相同，配合物2為新戊酸銅與槲皮素的產物，配合物3為苯甲酸銅與槲皮素的產物。研究發現，這幾個配合物具有較強的腫瘤抑制作用[8]。

圖1 配合物分子結構

本實驗對這3個配合物通過紫外光譜和凝膠電泳方法研究配合物與pBR322 DNA的作用形式與裂解能力，探究3種配合物的DNA作用機制。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器、試劑與藥品

紅外光譜使用Nicolet 380型紅外光譜儀，由KBr壓片法測定；凝膠成像使用美國BIO-RAD紫外凝膠成像系統分析；紫外光譜在thermo scientific紫外分光光度計上測定。

配合物參照文獻方法制備[8]，生化燃料溴化乙錠，EB北京博奧拓達科技有限公司；超螺旋pBR322 DNA，美國Fermentas公司；瓊脂糖，Spanish公司；其他試劑均為分析純。

1.2 配合物的合成

配合物1：槲皮素(4 mmol)溶解于熱的無水乙醇(50 mL)，加入新戊酸銅或苯甲酸銅(1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產物。IR(KBr,cm-1)：3 480 b～3 272 b,1 650 s，1 599 s,1 508 s,1 432 w,1 369 w,1 321 w,1 271 s,1 208 w,1 098 w,1 016 w,824 w,625 w。

配合物2：槲皮素(2 mmol)溶解于熱的無水乙醇(50 mL)，加入新戊酸銅(1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產物。IR(KBr,cm-1)：3 510 b～3 315 b,2 967 w,1 640 m,1 597 s,1 536 m,1 484 s,1 415 w,1 357 m,1 320 m,1 268 s,1 201 w,1 094 w,813 w,624 w。

配合物3：槲皮素(2 mmol)溶解于熱的無水乙醇(50 mL)，加入苯甲酸銅(2 mmol)，攪拌回流1 h，趁熱抽濾后得黑色產物。IR(KBr,cm-1)：3 510 b～3 315 b,2 967 w,1 640 m,1 597 s,1 536 m,1 484 s,1 415 w,1 357 m,1 320 m,1 268 s,1 201 w,1 094 w,813 w,624 w。

1.3 配合物與pBR322 DNA作用的紫外光譜

用甲醇溶解槲皮素和配合物1、2、3，然后用5 mmol/L Tris-NaCl-HCl、pH值為7的緩沖液稀釋至槲皮素為4.0×10-5mol/L，配合物為2.0×10-5mol/L，pBR322 DNA用Tris-NaCl-HCl緩沖液稀釋至0.125 μg/μL備用。參比池中加入380 μL緩沖液，樣品池中加入380 μL樣品溶液，在200 nm～600 nm波長范圍內掃描，再向參比池和樣品池中分別加入相同體積(1 μL/次)的0.125 μg/μL pBR322DNA，共加入5 μL，然后分別測定溶液的紫外吸收光譜圖。

1.4 配合物對pBR322 DNA的裂解實驗

槲皮素銅配合物對pBR322 DNA的切割活性由瓊脂糖凝膠電泳法測定。用DMSO將槲皮素銅配合物稀釋成7個質量濃度，分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、3.91 μg/mL。在每個EP管中加1 μL槲皮素配合物溶液，然后，加入Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液8 μL，最后，加入1 μL pBR322 DNA(0.25 μg/μL)混合，總體積10 μL；同時，設空白對照組，混合溶液放置在37 ℃恒溫水浴中避光反應2 h。反應結束后，從EP管中取3 μL產物與1 μL loading buffer混合，上樣到含有1.0 μg/mL溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠板，使用TAE緩沖溶液，在80 V/cm電壓下電泳，使用美國BIO-RAD紫外凝膠成像系統分析電泳結果。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜分析

金屬配合物分子的特征吸收譜帶會在加入DNA后發生變化。如發生插入作用，則該分子吸收光譜的吸收峰位置紅移，強度減小。因為插入配體與DNA堿基對可發生π電子堆積作用，配體的π×空軌道與堿基的π電子軌道發生偶合，使能級下降導致π→π×躍遷能減小，繼而產生紅移。同時，偶合后的π×軌道因部分填充電子，使π→π×躍遷幾率減小，產生減色效應。紅移的程度和減色效應均能反映出插入能力的大小。

槲皮素和配合物1、2、3在加入DNA后紫外光譜如圖2所示。槲皮素在290 nm和325 nm處有2個吸收峰，吸收峰隨著DNA不斷加入，強度降低，325 nm處發生紅移；配合物1、2在325 nm處具有較弱的吸收峰，加入DNA后，吸收峰的強度小幅度減小，但未見明顯紅移；配合物3的紫外吸收譜圖沒有明顯的紫外吸收峰，主要原因是，配合物中的槲皮素受到多個銅離子的影響，使苯環共軛效果減弱，因此紫外吸收峰不明顯，但是在加入DNA后紫外吸收有降低趨勢。綜合上述情況，槲皮素是以插入方式與DNA作用；配合物與DNA的作用方式不是明顯的插入方式，可以是插入、靜電和剪切作用多種形式與DNA共同作用，進而對DNA產生裂解效果。

圖2 槲皮素及配合物1、2、3加入DNA后紫外光譜的變化

2.2 裂解作用結果與分析

實驗運用凝膠電泳法，對槲皮素及配合物1、2、3對pBR322 DNA的裂解能力做了初步研究。pBR322 DNA為超螺旋DNA，配合物在以插入方式與超螺旋質粒DNA發生作用后，會引起DNA閉環超螺旋的解旋，變成開環缺刻型，使DNA的遷移率減小，直到超螺旋消失。配合物以靜電或溝區結合不會引起超螺旋的解旋。因此，解旋度是用作插入鍵合方式的證據之一，同時，DNA的解旋強度也反應配合物對DNA的裂解能力。

實驗首先檢驗反應原料和產物的DNA裂解能力。如圖3所示，在反應2 h后，槲皮素、新戊酸銅、苯甲酸銅3種原料未能對pBR322 DNA進行裂解，DNA保持Form Ⅰ形態；而配合物1、2、3在1.5 μg/mL時，具有明顯的作用，有Form Ⅱ的DNA形成。在對配合物1、2、3的裂解作用研究中，實驗使用梯度樣品濃度，作用于DNA。結果如圖4所示，3個配合物對DNA的裂解作用呈現濃度依賴。經過2 h的作用，在低濃度時，僅有部分裂解；在質量濃度達到1.88 μg/μL時，大部分DNA裂解。實驗還表明，在同一濃度下，作用時間越長，裂解的越多。

圖3 化合物對pBR322 DNA裂解能力

3 結論

本文研究了新型多核銅槲皮素配合物與DNA作用形式和對DNA的裂解作用。紫外光譜法和凝膠電泳實驗研究發現，配合物對DNA作用效果強于單體槲皮素。配合物通過插入、靜電、剪切多種形式與DNA作用，使其具有高效的DNA斷裂活性，在質量濃度為1.88 μg/μL時，作用2 h，基本全部裂解。

圖4 配合物1、2、3在不同濃度不對pBR322 DNA的裂解能力