高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中喹乙醇代謝物

□ 程春霞 王成梅 山東中質華檢測試檢驗有限公司

喹乙醇是一種合成的飼料添加劑，因為具有廣譜抗菌效果和促生長作用而廣泛應用于畜禽和水產品養殖。經研究表明，喹乙醇會在體內存積，具有明顯的蓄積毒性和DNA損傷等副作用。1998年歐盟禁止其應用于可食性動物。《中國獸藥典》2005版也明確規定禁止在家禽及水產養殖中使用喹乙醇。喹乙醇本身并不穩定，在體內短時間內會發生代謝，其代謝物有十幾種，大部分不是很穩定，不具備檢測條件，只有3-甲基喹惡啉-2-羧酸（MQCA）比較穩定，可以作為檢測的主要代謝物，是國家食品法典委員會認定的標示殘留物[1]。因此在檢測的過程中主要將其作為殘留分析和監控的目標物。

目前國際上對于喹乙醇代謝物的提取和檢測目前主要是通過酶解衍生，固相萃取凈化。該方法普遍存在著檢出限高、回收率低、操作過程繁瑣、耗時耗力的缺點，不適用于大批量的檢測。怎么才能快速的從豬肉中將其喹乙醇代謝物提取出來，是我們研究的主要方向。通過實驗比對，發現不過SPE柱，直接用2%偏磷酸甲醇（4∶1）溶液、乙酸乙酯提取，目標物分離效果好，基質干擾很少，檢出限0.1 μg/kg、陽性加標完全能達到檢測要求，大大節省了時間，降低了檢測成本，提高了回收率，提高了工作效率[2]。因此本實驗采用該方法作為我們的提取方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜串聯質譜聯用儀(美國安捷倫公司，型號Agilent1260/6460)、電子天平(德國賽多利斯公司，型號Secura513-1CN）、高速冷凍離心機(SIGMA公司，型號3K15)、純水機(北京普析，型號GWB-2E)、多功能振蕩器(德國海道夫公司，型號Multi Reax)、超聲波(天津奧特賽恩斯，型號AS30600BDT)、旋轉蒸發儀(IKA公司，型號RV10)[3]。

3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)(德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公 司 )；3-甲基喹惡啉-2-羧酸-d4(MQCA-d4，加拿大TRC公司)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯( 色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜純，國藥)。

標準溶液：精確稱取10 mg MQCA標準品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA標準儲備液，精確稱取1 mg MQCA-d4標準品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL，MQCA-d4L標準儲備液，-20 ℃以下避光保存[4]。

1.2 樣品前處理

取豬肉樣品充分絞碎，置于清潔樣品容器中，-20℃以下避光保存。

1.3 實驗步驟

稱取2.5 g樣品于50 mL離心管中，加入一定量的內標標準溶液，使其濃度為2.0 ng/mL。加入10 mL 2%偏磷酸甲醇（4∶1）溶液，渦旋10min，超聲20min，離心5 min，轉移上清液至另一離心管中，殘渣重復提取一次，合并提取液。在提取液中加入10 mL乙酸乙酯，渦旋10 min，超聲20 min，離心5min轉移上層（乙酸乙酯層）于干凈雞心瓶中，下層重復提取一次，合并提取液。在45 ℃水浴中旋轉蒸發儀旋轉蒸發至近干，用1 mL 0.1%甲酸乙腈（9∶1）溶液定容，過0.22 μm濾膜到進樣小瓶中，LCMS/MS上機檢測[5]。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Infinity Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)。柱溫：35 ℃。流動相：乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速為0.4 mL/min。進樣量：5 μL。流動相梯度洗脫條件見表1。

1.4.2 質譜條件

通過多反應監測（MRM）模式，在ESI正離子檢測模式下進行掃描，分別對MQCA和MQCA-d4進行優化，根據待測物的信噪比優化最佳噴霧電壓，獲得最佳優化條件：氣體溫度350 ℃，氣體流量13 L/min，噴霧器壓力40psi。質譜條件見表2。

在MRM模式下，喹乙醇代謝物的譜圖見圖。

1.4.3 線性方程與檢出限

配制MQCA的質量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L的標準工作液，內標濃度均為2.0 μg/L，標準溶液在0.1～10 μg/L范圍內線性范圍良好，標準曲線相關系數r=0.999，見圖2。

以加標樣本中待測化合物色譜峰的信噪比等于3對應的濃度為方法檢出限，確定豬肉中的MQCA的檢出限為0.1 μg/L。該方法檢出限比標準上0.5 μg/L高出很多，比很多文獻中的0.27 μg/L也高很多，證明在該方法條件下喹乙醇代謝物響應值高，該方法優于正常的檢測方法。

1.4.4 回收率試驗及精密度

取豬肉陰性樣品，通過加入3個不同濃度的標品測定其不同濃度下的回收率，實驗表明在0.5～5.0 μg/kg范圍內，豬肉中回收率在77.6%～92.2%范圍內，符合正常檢測的范圍。回收率及精密度見表3。

表1 流動相梯度洗脫條件

表2 喹乙醇代謝物的質譜條件

圖1 喹乙醇代謝物的色譜圖

圖2 喹乙醇代謝物的線性方程

表3 喹乙醇代謝物的回收率及精密度

2 結果與討論

由于喹乙醇代謝物在體內是與蛋白質通過結合狀態存在的，因此第一步需要將喹乙醇代謝物游離出來。目前有關這方面的報道有酸解、堿解、酶解，本實驗通過偏磷酸將其游離，喹乙醇代謝本身具有酸性，其水解液在酸性條件下可以通過乙酸乙酯提取出來，具有良好的提取率，同時酸解時間相比較酶解衍生16 h，大大縮短了時間。因此本實驗采用偏磷酸甲醇酸解，然后通過乙酸乙酯提取。本方法不過SPE柱，前處理方法簡便、快捷、易操作、靈敏度高、回收率高、節約成本，可準確進行定性、定量檢測，適用于豬肉中喹乙醇代謝殘留標示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的檢測。