注射用燈盞花素對脂多糖致巨噬細胞炎癥損傷的抑制作用

齊睿娟，孫桂波，侯 睿，高 源，費巧玲，韓宜芯，周 鴻，齊 云

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國中醫科學研究院西苑醫院老年病中心，北京 100091）

燈盞花素（breviscapine，BS）是從菊科植物短葶飛蓬〔Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.〕干燥全草中提取出的黃酮類成分，其中含量最高的是燈盞乙素。由于其在治療心腦血管疾病方面有確切的療效，已被開發為片劑、顆粒劑、注射劑和注射粉針劑等多種劑型應用于臨床［1］，最主要適應癥是冠心病、心絞痛和腦缺血等。據報道，BS中幾種黃酮生物利用度極低，因此其注射劑的臨床療效更為顯著［2］。近幾年，臨床上除將BS用于治療缺血性疾病外，也將其用于治療與炎癥密切相關的疾病。研究表明，BS均可降低缺血再灌注損傷和腦損傷大鼠腦組織中炎癥因子如白細胞介素6（interleu?kin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）的水平［3-5］。BS對脂多糖（lipopoly?saccharides，LPS）誘導的膿毒癥性急性肺損傷［6］和腎損傷［7］模型大鼠肺、腎組織內誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α和IL-1β均有明顯抑制作用，并可改善肺、腎組織損傷。不僅如此，BS還能通過抑制炎性凋亡及減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生，改善CCl4誘導的小鼠肝損傷［8］。這些研究結果拓寬了對BS通過改善缺血器官的供血、抗脂質過氧化、清除自由基并減輕細胞凋亡等保護缺血器官的認識［9］，提示其可能具有直接的抗炎和抗氧化作用。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要致病成分，是巨噬細胞等細胞膜上Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的配體，通過TLR4轉導的信號可活化巨噬細胞并產生大量的炎癥介質和ROS［10］。LPS活化的巨噬細胞模型主要用于考察受試物對TLR4信號轉導入胞內、激活NF-κB和轉錄因子活化蛋白1（activator protein-1，AP-1）產生大量炎癥介質的作用，是評價抗炎藥物最經典的體外模型。鑒于BS在炎癥疾病，包括在LPS誘導膿毒癥中的使用，本研究采用LPS活化巨噬細胞模型和致內毒素血癥小鼠模型觀察BS注射液（BS injection，BSI）的抗炎作用及對巨噬細胞的保護效應，以期闡釋BSI在炎癥疾病中的應用價值，為臨床合理應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、藥物、試劑和主要儀器

健康雄性ICR小鼠，20～23 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物合格證號SCXK（京）2016-0006。小鼠常規飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級實驗動物中心，許可證號為SYXK（京）2017-0020，室溫20～25℃，濕度55%～70%，12/12 h光照/黑暗，自由飲水攝食。

小鼠巨噬細胞RAW264.7購自美國ATCC細胞庫。RAW264.7細胞用含10%（V/V）胎牛血清的DMEM培養基在37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養，每3 d傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

BSI（國藥準字 Z20053907，批號 2014090H，含燈盞乙素96.6%），購自昆明龍津藥業股份有限公司，預先用無菌生理鹽水配制成濃度為10 g·L-1的儲備液，用時稀釋。

DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；LPS、光澤精（lucigenin）、磺胺和N-1-萘乙二胺基二鹽酸鹽購自美國Sigma-Aldrich公司；還原型輔酶二鈉（NADHNa2）和吩嗪二甲基硫酸鹽（PMS）購自美國Fluka公司；氯化硝基四氮唑藍（NBT）購自上海前進試劑廠；EDTA·2H2O購自美國Bio Basic公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自美國Amresco公司；亮肽素（leupeptin）購自瑞士Roche公司；L-012探針購自日本和光純藥株式會社；JC-1線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；ATP檢測試劑盒購自北京威格拉斯生物技術有限公司；小鼠巨噬細胞集落刺激因子（mouse colony-stimulating factor，M-CSF）購自北京義翹神州科技有限公司；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購自美國Biolegend公司。

Napco 5410型二氧化碳孵箱購自美國NAPCO公司；Multiskan Ascent酶標儀購自美國Thermo Electron公司；Infinite M1000微孔板檢測系統購自瑞士Tecan公司；微孔板恒溫振蕩器購自杭州奧盛儀器有限公司；雷磁PHS-3B型精密pH計購自上海精密科學儀器有限公司；LD5-2A離心機購自北京醫用離心機廠；細胞培養板和酶標板購自美國Corning公司。

1.2 小鼠髓源巨噬細胞的制備

小鼠髓源巨噬細胞的制備參考文獻［11］。將小鼠處死取股骨，用DMEM培養基沖洗，過濾骨渣并除紅細胞后離心，以完全培養基重懸細胞。加入終濃度為100 μg·L-1的M-CSF，分化培養5 d。其間每24 h補充終濃度為100 μg·L-1的M-CSF，第6～9天分化好的細胞（由不貼壁細胞轉變為貼壁細胞）用于實驗。

1.3 MTT法測定巨噬細胞存活率［12］

取對數生長期RAW264.7細胞以每孔2×105接種于96孔板中，加入BSI 6.25～400 mg·L-1（終濃度），細胞對照組加等體積培養基，本底組加等體積培養基代替細胞懸液（調零孔）。37℃孵育20 h后，加入MTT 20 μL（5 g·L-1），37℃繼續孵育4 h，吸除上清，加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，在540 nm處測吸光度值（A540nm）。細胞存活率（%）=給藥組A540nm/細胞對照組A540nm×100%。

1.4 LPS活化巨噬細胞體外模型的制備及上清中炎癥因子的測定［12］

取對數生長期RAW264.7細胞按每孔2×105接種于96孔板，或小鼠髓源巨噬細胞按每孔6×105接種于48孔板；模型組加入LPS（終濃度40 μg·L-1），BSI組加入LPS（40 μg·L-1）和BSI（終濃度1.5625～50 mg·L-1），對照組用等體積培養基替代BSI和LPS，于37℃孵育24h后取上清，Griess法測定上清中NO2-的含量，以代表NO分泌水平，按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-6水平。

1.5 LPS致內毒素血癥小鼠模型的制備及血清中炎癥因子的測定［13］

將雄性ICR小鼠隨機分為5組：正常對照組、模型對照組和模型+BSI 2.5，5和10 mg·kg-1組，每組8只。除正常和模型對照組外，其余各組小鼠一次性ip給予BSI，正常和模型對照組給予等量生理鹽水。給予BSI 0.5 h后，模型對照組和模型+BSI組小鼠尾靜脈注射LPS 5 mg·kg-1，正常對照組給予等量生理鹽水。給予LPS后3 h，各組小鼠眼球取血，4℃靜置過夜，4℃下1600×g離心10 min，收集血清備用。

采用改良的Griess法［14］測定血清中NO。將氯化釩（VCl3）溶于1 mol·L-1HCl中，與待測血清按1∶1比例混合，室溫避光反應30 min。按原血清體積與混合液〔甲醇∶乙醚=3∶1（V/V）〕1∶9比例進行混合，于4℃靜置過夜。4℃條件下1600×g離心10 min，取上清液與Griess試劑等體積混合，室溫振蕩孵育5 min，測定A540nm。以亞硝酸鈉標準曲線來確定其亞硝酸鹽含量。血清中TNF-α和IL-6含量按照ELISA試劑盒說明書測定。

1.6 RAW264.7細胞ROS，MMP和ATP水平的測定

取對數生長期RAW264.7細胞按每孔2×105（ROS）或3×106（MMP和ATP）分別接種于96孔板或48孔板，模型組加入LPS（終濃度40 μg·L-1），BSI組給予LPS（40 μg·L-1）和BSI（終濃度1.5625～50 mg·L-1），細胞對照組用等體積培養基替代BSI和LPS。37℃孵育24 h后，L-012熒光染色法測定細胞內ROS濃度［15］，JC-1熒光染色法檢測細胞內MMP水平［16］，熒光素酶催化底物熒光素發光反應檢測RAW264.7胞內ATP水平［17］。

1.7 NADH-PMS體系NBT法測定超氧陰離子清除能力［18］

用PBS 0.1 mol·L-1（pH7.4）稀釋BSI至終濃度為1.5625～ 50 mg·L-1，按每孔50 μL加入96孔酶標板，陰性對照組加等體積PBS代替BSI。依次加入 150 μmol·L-1PMS 溶液、1.2 mmol·L-1NADH?Na2溶液和360 μmol·L-1NBT溶液各50 μL（本底組以等體積0.1 mol·L-1PBS代替），在微型振蕩器上振蕩30 s，室溫反應5 min，在酶標儀540 nm處測A540nm。

1.8 化學發光法測定RAW264.7細胞內NADPH氧化酶活性［19］

取對數生長期RAW264.7細胞，以每孔3×106細胞接種于12孔板中，模型組加入LPS（終濃度40 μg·L-1），BSI組給予LPS（40 μg·L-1）和BSI（終濃度1.5625～50 mg·L-1），細胞對照組用等體積培養基替代BSI和LPS。37℃繼續孵育6 h，冰上超聲破碎細胞得到溶胞液。加入NADPH（10 mmol·L-1）10 μL，室溫避光反應15 min，加5 mmol·L-1光澤精80 μL溶液，混勻后立即測定化學發光值。

1.9 統計學分析

實驗結果數據以±s表示。組間均數比較采用單因素方差分析。IC50通過量效曲線回歸方程計算。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BSI對小鼠巨噬細胞RAW264.7存活率的影響

MTT法測定結果（圖1）表明，BSI在6.25～100 mg·L-1濃度范圍內，對RAW264.7細胞存活無明顯影響；BSI 200和400 mg·L-1明顯抑制RAW264.7細胞存活（P＜0.01）。為此，后續實驗BSI的終濃度均＜100 mg·L-1。

Fig.1 Effect of breviscapine injection（BSI）on cell viability of RAW264.7 macrophages by MTT assay.The cells were incubated with BSI for 24 h.Cell viability（%）=A540 nmof BSI group/A540 nmof cell control group×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 BSI對LPS活化RAW264.7巨噬細胞和小鼠髓源巨噬細胞分泌炎癥因子的作用

圖2A結果顯示，與細胞對照組比較，LPS孵育RAW264.7細胞24 h可顯著增加細胞上清中NO（以上清中NO2-含量反映），TNF-α和IL-6含量（P＜0.01）；BSI 25和50 mg·L-1組NO含量較LPS組顯著降低（P＜0.01）；BSI 1.5625～50 mg·L-1組TNF-α含量較LPS組無明顯變化，IL-6含量較LPS組明顯升高（P＜0.01）。BSI 1.5625～50 mg·L-1對小鼠髓源巨噬細胞上清NO，IL-6和TNF-α也無明顯的抑制作用（圖2B），與上述結果基本一致。提示BSI體外抗炎作用不明顯。

2.3 BSI對LPS誘導內毒素血癥模型小鼠血清中炎癥因子的作用

圖3結果所示，LPS 5 mg·kg-1可顯著增加小鼠血清中NO，IL-6和TNF-α水平（P＜0.01），給予BSI 2.5，5和10 mg·kg-1對該模型小鼠血清中3種炎癥因子水平均無顯著影響，表明BSI體內抗炎作用不明顯。

Fig.2 Effect of BSI on supernatant nitric oxide（NO），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）in lipo?polysaccharides（LPS）-primed RAW264.7 macrophages（A）and mouse bone marrow derived macrophages（B）.The cells were treated with BSI 1.5625-50 mg·L-1with or without LPS（40 μg·L-1）for 24 h.Nitrite level（A1 and B1）in the culture medium was measured by the Griess reaction.Supernatant TNF-α（A2 and B2）and IL-6（A3 and B3）levels were determined by ELISA.±s，n=3.＊＊P＜ 0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.3 Effect of BSI on serum NO（A），TNF-α（B）and IL-6（C）levels in LPS-induced endotoxemia mice.Mice were ip given BSI 30 min before LPS 5 mg·kg-1intravenous injection.Three hours after LPS challenge，the mice were sacrificed and the serum NO，TNF-α and IL-6 were measured.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control；#P＜0.05，compared with LPS group.

2.4 BSI對LPS活化RAW264.7巨噬細胞ROS，MMP和ATP水平的影響

如圖 4A 所示，LPS 40 μg·L-1可顯著升高RAW264.7細 胞 內 ROS 水 平（P＜0.01），BSI 1.5625～50 mg·L-1可顯著抑制LPS致細胞ROS水平的升高（P＜0.01），顯示出良好的抗氧化作用。

如圖4B 所示，LPS 40 μg·L-1處理RAW264.7細胞24 h，可使胞內綠色/紅色熒光比值明顯升高（P＜0.01），提示此時細胞MMP發生了去極化；BSI 6.25～50 mg·L-1則能顯著減少綠色/紅色熒光比值（P＜0.01），提示BSI可有效減緩LPS誘導的MMP去極化作用。

圖4C 顯示，LPS 40 μg·L-1可致RAW264.7細胞內 ATP 含量明顯下降（P＜0.01），BSI 3.125～50 mg·L-1能顯著升高胞內ATP含量（P＜0.01），提示BSI能有效對抗LPS所導致胞內ATP下降。

Fig.4 Effect of BSI on levels of reactive oxygen species（ROS）（A），mitochondrial membrane potential（MMP）（B）and ATP（C）in LPS-primed RAW264.7 macrophages.See Fig.2 for the cell treatment.ROS，MMP and ATP were deter?mined by L-012 assay，JC-1 assay and firefly luciferase reaction，respectively.±s，n=3.＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

2.5 BSI對超氧陰離子的直接清除作用

圖5所示，BSI在3.125～ 50 mg·L-1濃度范圍內，具有明顯的直接清除超氧陰離子的作用，且呈良好的濃度效應關系（R2=0.999，P＜0.05）。IC50為118.55 mg·L-1。

Fig.5 Effect of BSI on scavenging activity of super?oxide anion.The scavenging activity of BSI on superoxide anion was determined by NADH-NBT-PMS reaction.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

2.6 BSI對LPS活化RAW264.7細胞NADPH氧化酶活性的作用

圖6結果顯示，與細胞對照組比較，LPS可致RAW264.7細胞內NADPH氧化酶活性明顯增高（P＜0.01）；與LPS組比較，BSI則能顯著抑制LPS活化的NADPH活性（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of BSI on intracellular NADPH oxidase activity in LPS-primed RAW264.7 cells.See Fig.2 for the cell treatment.The NADPH oxidase activity was determined by chemiluminescence after six-hour cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

3 討論

臨床上BS主要用于治療卒中及其后遺癥、冠心病和心絞痛等疾病。近年其臨床應用逐步擴大，尤其是在一些與炎癥密切相關的病癥上應用漸多，如骨性關節炎［20］、慢性阻塞性肺病［21］、肺纖維化［22］、急性胰腺炎［23］、病毒性心肌炎［24］和慢性腎小球腎炎［25］等，或聯用或單用。據報道，鞘內給予燈盞乙素（BSI中最主要成分），可明顯抑制甲醛誘導的大鼠炎癥疼痛反應、脊髓NOS的表達及NO水平，顯示其可能的抗炎作用［26］。但由于炎癥種類繁多，所涉及的信號轉導通路及細胞因子各異，BS對LPS誘導膿毒癥急性腎損傷的保護［7］等作用是通過抑制炎癥還是保護細胞來實現的均不甚清楚。

巨噬細胞活化是宿主防御致病微生物的關鍵過程，進而導致炎癥級聯反應的開始和炎性介質的釋放［27］。作為革蘭陰性菌壁的主要成分，LPS可與巨噬細胞膜上TLR4的識別結合，觸發下游信號接頭蛋白MyD88的募集，后者又引起一系列信號級聯反應使得IκB激酶（inhibitory kappa B kinase，IKK）或絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活［28］。IKK使IκB發生磷酸化，進而釋放轉錄因子如P65等入核，而MAPK包括P38，ERK1/2和JNK，激活后會使轉錄因子c-FOS等活化入核。核內的轉錄因子與靶基因啟動子或增強子區特異性序列結合，發揮其轉錄調節功能，產生如iNOS，TNF-α和IL-6等促炎因子［29-30］。抗炎藥物往往是通過抑制NF-κB/AP-1來發揮抗炎作用的。

在不影響細胞存活的濃度范圍內，BSI對LPS活化巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6無抑制作用，提示其可能對NF-κB/AP-1信號通路無相應的抑制作用。本研究發現，BSI在25和50 mg·L-1時對LPS活化的RAW264.7細胞上清中NO含量有抑制作用，但在原代巨噬細胞并未顯示該作用。再綜合BSI對該2種細胞TNF-α和IL-6分泌無抑制作用，推測BSI對TLR4信號通路無抑制作用。

值得一提的是，BSI在實驗濃度范圍內，對LPS活化RAW264.7細胞（不包括原代巨噬細胞）上清中IL-6，不僅無抑制作用，反而可促進其生成。但體內實驗并不支持BSI升高LPS活化RAW264.7細胞IL-6結果。總之，無論是體外LPS活化巨噬細胞模型，還是體內內毒素血癥模型，BSI均未顯示出其抗炎作用，此結果3個模型是一致的。

在LPS活化細胞膜TLR4通路轉導炎癥信號的同時，它還能活化細胞膜上NADPH氧化酶等引起胞內ROS增加［31］。BSI抗炎作用不明顯，臨床卻將其用于與炎癥相關的病癥，包括膿毒癥，推測BSI在這些病癥中發揮了抗炎以外的作用。考慮到BS在治療缺血性疾病中突出的抗氧化作用，推測其有可能通過抗氧化來實現對炎癥相關細胞（如中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞等）的保護作用。

LPS刺激RAW264.7細胞除可引起經典的炎癥因子釋放以外，還可引起細胞的其他損傷，如MMP水平的下降和胞內ATP被大量耗損等。細胞內的這些病理現象主要源于LPS能誘導胞內ROS的產生。對此，BSI既能直接清除超氧陰離子，又能抑制NADPH氧化酶以減少ROS的生成，通過抑制胞內ROS的升高來改善因ROS引起的MMP下降和ATP耗損以達到保護細胞的作用。

綜上，BS雖無明顯抗炎作用，卻在炎癥相關疾病中有應用，這可能與其阻止炎癥損傷所致細胞內ROS升高、消除因ROS升高引起的MMP下降和ATP耗損，從而達到保護細胞（組織）作用有關。與本研究一致的是，近年來臨床也越來越多地將BS聯合抗炎藥物用于炎癥相關疾病［1-4］。本研究可能為擴大BS的臨床適應癥范圍以及指導其在炎癥相關疾病的臨床使用方面提供實驗支撐。