新疆南疆部分地區 3 種璃眼蜱的分子生物學鑒定

李凱瑞，李 飛,2，何 波，張路瑤,3，趙 麗,4，劉永宏,4

(1.塔里木大學 動物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆阿克蘇地區動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；3.巴里坤哈薩克自治縣畜牧獸醫工作站，新疆哈密 839200； 4.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

蜱隸屬節肢動物門(Arthropoda)蜘蛛綱(Arachnida)螨亞綱(Acari)寄螨總目(Parasitiformes)蜱目(Ixodida)蜱總科(Ixodoidea)，是一類專性吸血的體外寄生蟲，能寄生包括人在內的多種脊椎動物[1-2]。對宿主最直接的危害為生產性能降低和增量變慢，嚴重的會導致死亡。除直接危害，蜱也是傳染性動物疾病最常見的媒介，能夠傳播多種病原，包括細菌、病毒、血液原蟲、螺旋體和立克次體等，對人類、寵物、野生動物和牲畜構成嚴重威脅，在很大程度上給診斷和防治帶來嚴峻挑戰[3-4]。

全世界蜱類大約900多種，分為3個科：硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和納蜱科(Nuttalliellidae)。硬蜱科中的璃眼蜱屬(Hyalomma)包括3個亞屬，共有27個種。中國的璃眼蜱均屬于同一亞屬，已記載的有9個種[5-6]。新疆是中國陸地面積最大的省級行政區，占中國總面積的1/6，無論是地理氣候，還是牲畜種群，都為蜱提供良好的生存環境，其中天山橫亙于新疆中部，把新疆分為南疆和北疆，璃眼蜱屬是南疆的優勢蜱屬之一[7]。

蜱類的鑒定主要有形態學鑒定和分子生物學鑒定，后者近年在系統分類學中的應用越來越廣泛[8]。常用鑒定基因有：核糖體RNA基因，分為18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA、非轉錄間隔區(NTS)、轉錄間隔區(ITS)和基因間隔區(IGS)；線粒體DNA，分為12S rRNA、16S rRNA、細胞色素氧化酶、細胞色素b、22個tRNA和2個ATP酶基因[9-10]。線粒體DNA中的12S rDNA和16S rDNA通常用來分析蜱的種間變異、種內變異和種群水平，在多個蜱種中均有應用[11-13]。這2個基因均較保守，相比于其他同類基因進化速率不高，可以被通用引物或者保守引物PCR擴增，16S rDNA在蜱的分類系統進化分析中擴增序列可獲得更多位點信息，擴增的物種也更多[14]。本研究通過12S rDNA和16S rDNA進行分子生物學鑒定，確定南疆部分地區璃眼蜱分布情況，為蜱傳病的流行病學調查及疫病風險防控工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蜱 共采集559只璃眼蜱屬蜱，采集時間、地點和分布見表1。

表1 蜱的來源Table 1 Source of ticks collection

1.1.2 主要試劑及儀器 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 (Code No. 9765)、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMvesion 2.0)(Code No. R004A)和DNA marker DL2000(Code No. 3427A)購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀(TC-5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(R134a, Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY-12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S，北京君意東方電泳儀設備有限公司)等。

1.1.3 線粒體 12S rDNA和 16S rDNA基因擴增引物 蜱類線粒體12S rDNA和16S rDNA特異性基因片段PCR擴增引物[15-16]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表2。

1.1.4 蜱物種鑒定參考序列 亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和殘緣璃眼蜱物種鑒定所選取的參考序列見表3。

表2 蜱 12S rDNA和 16S rDNA基因片段擴增引物Table 2 Primers for amplification of 12S rDNA and 16S rDNA gene fragments of ticks

注： W 對 A 或 T(W 為兼并引物，表明該位置2種堿基擇1)。

Note：W pairs A or T (W is merger primer to indicate location of two bases).

表3 蜱物種鑒定參考序列Table 3 sequences for identification of tick species

1.2 方 法

試驗在新疆阿拉爾市塔里木大學動物科學學院和新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室進行。

1.2.1 蜱樣本篩選 收集新疆南疆蜱蟲樣本，通過形態學鑒定初步篩選出璃眼蜱屬蜱做好標記，用蒸餾水反復沖洗掉體表的異物，置于滴加甘油的φ=75%酒精中保存，供鑒定，其他于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 蜱DNA提取 選取要鑒定的璃眼蜱樣本，將蜱依次在φ=50%、φ=30%、φ=10%的酒精、自來水和蒸餾水中各浸泡1 h。清洗潔凈后，剪成小塊置于EP滅菌管中，根據TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer. 5.0試劑盒說明提取蜱組織DNA。

1.2.3 分子生物學鑒定根據TakaRaTaqTMVersion 2.0試劑盒說明設置12S rDNA和16S rDNA基因PCR反應體系，具體見表4。

表4 PCR 反應體系Table 4 PCR reaction system

12S rDNA基因PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，51 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個循環；94 ℃變性15 s，53 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，25個循環；70 ℃延伸5 min。

16S rDNA基因PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個循環；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個循環；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個循環；94 ℃變性30 s，43 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，25個循環；68 ℃延伸5 min。

1.2.4 電泳及凝膠成像觀察 取5 μL PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察結果并記錄。

1.2.5 測序及序列分析 將PCR陽性產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，利用鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)將測序結果與亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和璃眼蜱屬其他序列，以及圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalusturanicus)、血紅扇頭蜱(Rhipicephalussanguineus)、波斯銳緣蜱(Argaspersicus)、銳跗硬蜱(Ixodesacutitarsus)和蠕形螨(Demodexcanis)作為外緣種(Outgroup)進行同源性及系統進化分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增

提取經形態學鑒定為璃眼蜱屬13只蜱的基因組DNA， 對12S rDNA和16S rDNA基因進行PCR擴增。由圖 1 和圖 2 可知，試驗陰、陽性對照成立，且樣品獲得目的片段與預期大小一致。初步分析12S rDNA和16S rDNA基因均成功擴增，蜱種類確定需要結合測序結果進行分析。

M. DNA分子質量標準 DL2000 DNA marker DL2000; 1.陽性對照 Positive control; 2. 陰性對照 Negative control; 3～10. 12S rDNA 基因 12S rDNA gene

M. DNA分子質量標準 DL2000 DNA marker DL2000; 1～8. 16S rDNA 基因 16S rDNA gene; 9. 陰性對照 Negative control; 10. 陽性對照 Positive control

2.2 12S rDNA序列分析

基于璃眼蜱12S rDNA基因擴增片段，13段自測序列間的同源性為85.7%～99.7%。1、5、7、11、13的同源性較高，2、3、4、8、9、10、12的同源性較高，6與其他序列的同源性均較低(表5)。結合形態學鑒定結果認為：1、5、7、11、13為同一種璃眼蜱，2、3、4、8、9、10、12為同一種璃眼蜱，6為單獨一種璃眼蜱。

表5 基于璃眼蜱 12S rDNA基因的13段自測序列同源性比對Table 5 Homology comparison of 13 self test sequences based on 12S rDNA gene fragments of Hyalomma

同源性分析結果顯示，序列8與小亞璃眼蜱(登錄號：KF583616)同源性為100%，2、3、4、9、10和12與小亞璃眼蜱(登錄號：KF583616)同源性均為99%；6與亞洲璃眼蜱(登錄號：KF583591)同源性為98%；1和13與殘緣璃眼蜱(登錄號：KF583607)同源性為99%，5、7和11與殘緣璃眼蜱(登錄號：KF583607)同源性為98%。系統進化關系顯示，1、5、7、11、13與殘緣璃眼蜱位于同一個進化支上；2、3、4、8、9、10、12與小亞璃眼蜱位于同一個進化支上；6與亞洲璃眼蜱位于同一個進化支上，且與不同屬的扇頭蜱和其他外圍群處于不同分支(圖3)。進化樹中，同一屬或同一種的璃眼蜱均能聚為一支，12S rDNA基因可以為這3種璃眼蜱提供分類依據。綜合序列分析結果及形態學鑒定結果，可以確定此次采集的璃眼蜱屬于樣本殘緣璃眼蜱、小亞璃眼蜱和亞洲璃眼蜱。

2.3 16S rDNA序列分析

測序結果顯示，序列2(阿克蘇地區庫車縣)和10與小亞璃眼蜱(登錄號：JX051108)同源性分別為98%和99%，6與亞洲璃眼蜱(登錄號：KU880611)同源性為99%。

系統進化關系顯示，2和10與小亞璃眼蜱位于同一個進化支上；6與亞洲璃眼蜱位于同一個進化支上，且與同屬不同種的其他璃眼蜱、不同屬的扇頭蜱及其他外圍群處于不同分支(圖4)。進化樹中，同一屬或同一種的璃眼蜱均能聚類，表明16S rDNA基因可以為小亞璃眼蜱和亞洲璃眼蜱提供分類依據。

3 討 論

近年來，關于蜱類的研究越來越深入和廣泛。在蜱實驗室人工飼養[17]及制備蜱疫苗候選抗原[18]等諸多研究中，蜱準確分類鑒定是前提和基礎。形態學鑒定結果容易受到外界因素影響，如蜱樣本不完整或處于不同的發育階段、鑒定人員經驗不足、以及形態非常相似的其他隱藏種和姐妹種等，都會影響鑒定的準確性[19]。目前，常用形態學結合分子生物學方法進行蜱種類鑒定，從分子水平提高鑒定的準確性，可為蜱類分布提供可靠依據。本研究基于12S rDNA和16S rDNA基因，將新疆南疆部分地區形態學鑒定的璃眼蜱屬蜱鑒定為3種。

另一方面，蜱類分布可能會因當地氣候、地理分隔和歷史上的國際牲畜貿易而發生變化[20]。璃眼蜱屬中小亞璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)、亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)和殘緣璃眼蜱(Hyalommadetritum)不同地區分布均有差別[21]。王冰潔[22]在新疆哈密、克拉瑪依等多個地區的調查中得出璃眼蜱的區系分布指數由低到高為：亞洲璃眼蜱(H.asiaticum)、殘緣璃眼蜱(H.detritum)和小亞璃眼蜱(H.anatolicum)。劉繼榮等[23]發現在吉木薩爾縣、木壘縣、布爾津縣和石河子莫索灣等地均有小亞璃眼蜱(H.anatolicum)、亞洲璃眼蜱(H.asiaticum)和殘緣璃眼蜱(H.detritum)分布。蜱在當地分布的系統性調查對蜱種群分布變化、新種發現和蜱傳病的流行病學評估等至關重要[24]。本研究確定巴音郭楞蒙古自治州和靜縣、阿克蘇地區庫車縣、新疆生產建設兵團第三師50團、阿克蘇地區阿瓦提縣、吐魯番地區鄯善縣分布有小亞璃眼蜱；阿克蘇地區溫宿縣分布有亞洲璃眼蜱；喀什地區莎車縣、和田地區皮山縣、阿克蘇地區溫宿縣、和田地區策勒縣、和田地區和田縣分布有殘緣璃眼蜱。調查結果為新疆南疆部分地區蜱及蜱傳病的防控奠定基礎。

圖3 12S rDNA基因核苷酸序列NJ法種系發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 12S rDNA gene nucleotide sequence by NJ method

圖4 16S rDNA基因核苷酸序列NJ法種系發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene nucleotide sequence by NJ method