蜻蜓鳳梨 AfACO1基因的克隆及乙烯響應特性分析

雷 明，王加賓，李志英，徐 立

(1.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571700；2.農業部華南作物基因資源與種質創制重點實驗室，海南儋州 571700；3.海南省熱帶作物種質資源遺傳改良與創新重點實驗室，海南儋州 571700；4.國家種質資源熱帶作物中期保存庫，海南儋州 571700)

鳳梨科(Bromeliaceae)植物包括58個屬3 248個種，形態多樣，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區[1-2]。人工栽培的鳳梨可以分為2大類，一類是食用鳳梨，即菠蘿(Ananascomosus)，一類是觀賞鳳梨。觀賞鳳梨形態多樣、花期持久，雖然自20世紀90年代中期傳入中國到現在不過30來年的時間，但市場發展迅速，已成為僅次于蘭花和紅掌的第3大熱帶花卉。

乙烯是一種重要的植物激素，參與種子萌發、幼苗生長、開花誘導、果實成熟、器官衰老和病原菌響應等諸多過程[3-4]。乙烯生物合成起始于S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)。從SAM合成乙烯需要2個關鍵的限速酶[5-6]。首先，在1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACC)合成酶(ACC synthase，ACS)的作用下，SAM被催化成ACC。其次，在ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)的作用下，ACC被催化成乙烯。通常植物內源乙烯一直維持在較低的水平，但生長發育階段及脅迫處理會使其表達迅速上調，而在這個過程中，ACO至關重要[7-9]。ACO屬于2OG-加氧酶超家族，該家族的酶利用非血紅素Fe2+為輔因子，將分子氧整合進其他生物分子中。該家族的諸多成員具有一個高度保守的Fe2+結合基序，該基序由2個組氨酸和1個酸性氨基酸殘基(Glu/Asp)組成[10-12]。ACO的反應底物為抗壞血酸，且需要CO2為激活因子[13]。

施加外源乙烯或乙烯衍生物(如乙烯利、乙炔等)可以促進鳳梨科植物開花。利用14C 標記的乙烯利處理菠蘿，4 h時，30%的乙烯利進入葉片，24 h時，60%的乙烯利進入葉片[14]。施用內源乙烯合成抑制劑aminoethoxyvinylglycine(AVG)能夠延遲菠蘿的自然開花時間，且乙烯誘導開花的時間也延長了[15-17]。因此，乙烯誘導鳳梨科植物開花主要是外源乙烯引起內源乙烯含量增加所致。但到目前為止，鮮有關于鳳梨科植物內源乙烯合成關鍵酶ACO編碼基因的克隆和功能鑒定的報道。

蜻蜓鳳梨(Aechmeafasciata)是一種廣泛栽培的觀賞鳳梨品種。本研究首次從蜻蜓鳳梨中克隆了ACO家族編碼基因AfACO1，利用生物信息學技術對其編碼的蛋白進行結構分析，驗證其轉錄本的組織表達特異性，并研究其響應外源乙烯處理的表達模式。為進一步解析AfACO1在內源乙烯合成中的作用以及通過基因工程手段調控鳳梨科植物開花提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

蜻蜓鳳梨取自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所離體保存與繁育研究室大棚(30～32 ℃)。幼株和成株分別為試管苗移栽成活后株齡6個月和11～14個月的植株。外源乙烯利處理時，分別取20 mL 不同試驗質量濃度(0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 g/L)的乙烯利灌心處理1、2、4、8、24、48 h，以清水灌心的材料為對照。不同組織材料在處理后迅速于液氮中冷凍，置于-80 ℃保存，備用。

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈的合成

采用改良的CTAB法提取蜻蜓鳳梨總RNA。cDNA第1條鏈的合成采用TranScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(Transgene)，具體過程按照試劑盒說明書進行。

1.3 5′和3′ RACE

首先參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)的說明書合成5′和3′ RACE模板。根據已有的414 bp的序列，分別設計了5′和3′特異引物進行全長cDNA的擴增。其中，5′的外側引物GSP51和內側引物GSP52以及3′的外側引物GSP31和內側引物GSP32的序列見表1。采用OMEGA(Omega)的膠回收試劑盒純化PCR條帶。純化后的特異條帶分別連接到pEASY-blunt克隆載體上，測序。測序后的條帶與轉錄組序列拼接后再做進一步驗證分析。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI網站的ORF Finder在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進行開放閱讀框的預測分析；利用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列的同源性比對；利用MEGA 6.0軟件和鄰接法進行進化樹構建；利用ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質相對分子質量和等電點；利用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析蛋白質的保守基序；利用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結構示意圖。

1.5 總DNA的提取及 AfACO1基因組序列的克隆

采用改良的CTAB法提取蜻蜓鳳梨的總DNA。依據AfACO1的CDS序列設計引物(AfACO1CDS F和AfACO1CDS R)以DNA為模板擴增AfACO1的基因組序列。具體引物序列參見表1。

1.6 實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)

PCR反應選用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(Transgene)在Therma PikoReal 96TM熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)上進行。反應體系(10 μL)：qPCR混合反應液SuperMix 5 μL，模板1 μL，正反向引物各0.3 μL，滅菌的去離子水補齊至10 μL；反應程序：95 ℃預變性7 min，然后在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件下擴增40個循環，循環結束后65 ℃ 30 s，20 ℃停止。每個樣品2個生物學重復，3次技術重復。以蜻蜓鳳梨的β-actin(AfACTB)為內參采用雙delta法分析數據。目的基因和內參基因的擴增效率通過制作標準曲線獲得。所有引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 AfACO1 cDNA全長的克隆與序列分析

轉錄組數據獲得1個與擬南芥ACO基因同源的片段。基于此，設計了RACE擴增引物，分別擴增得到了該基因的5′端序列和3′端序列(圖1-A和B)。在此基礎上，成功克隆了AfACO1cDNA 732 bp的全長(圖1-C)。分析后發現，其含有1個63 bp的5′非編碼區(5′ untrascriptional region，5′-UTR)，1個198 bp的3′-UTR，以及1個471 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼156個氨基酸殘基。

基于AfACO1的ORF序列，筆者從蜻蜓鳳梨的DNA中克隆了AfACO1基因的全長，并對其基因結構進行分析，結果顯示，不同于擬南芥的5個ACOs基因和水稻中的2個ACO1-likes基因序列結構，AfACO1基因由2個外顯子和1個內含子組成(圖2)。基因結構的差異暗示AfACO1可能具有某些功能上的差異性。

2.2 AfACO1蛋白的同源性和進化樹分析

ProtParam在線軟件計算結果顯示，AfACO1蛋白相對分子質量為17.47 ku，等電點為8.46。為了探究AfACO1與其他物種中ACOs蛋白的進化關系，用鄰接法(the neighbor-joining method，NJ method)構建進化樹。結果表明，AfACO1與水稻(Oryzasativaspp.japonicacv.Nipponbare)中的2個OsACO1-like蛋白親緣關系最近，暗示它們在功能上可能具有一定的保守性(圖3)。

基于進化樹分析結果，進一步對AfACO1蛋白的序列進行同源性比對。結果顯示，AfACO1具有ACO的典型結構特征，即分別有輔因子亞鐵離子結合位點(His-Xaa-Asp-Asp-Xaa-His)以及ACO家族蛋白輔助底物抗壞血酸結合位點(Arg-Xaa-Ser)(圖4)，暗示AfACO1可能是蜻蜓鳳梨中功能ACO。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

A.RACE PCR擴增 AfACO1 cDNA的5′端序列 RACE PCR amplification of 5′ fragments of AfACO1 cDNA；B.RACE PCR擴增 AfACO1 cDNA的3′端序列 RACE PCR amplification of 3′ fragments of AfACO1 cDNA；C.PCR擴增 AfACO1 cDNA的全長 PCR amplification of full length of AfACO1 cDNA；M.DL2000 marker

為了進一步探究AfACO1可能的功能，利用MEME在線軟件對其全序列中的保守基序進行解析。由圖5可知，相對于擬南芥的5個ACOs的8或9個基序數量來說，AfACO1的保守基序較少，只有4個，且這4個基序的序列更類似于水稻中的2個ACO1-likes的保守基序。

2.3 AfACO1在蜻蜓鳳梨中的表達特性

為了研究AfACO1在蜻蜓鳳梨各組織中的表達特性，提取了蜻蜓鳳梨幼株、成株和抽薹39 d后的成株的外葉、心葉、莖和根的RNA，反轉錄成cDNA，并以此為模板進行qPCR檢測。AfACO1的轉錄本在抽薹39 d后的成株的心葉和根中有顯著高的表達，而在各個生長時期的莖中表達量一直較低(圖6-A)。此外，還檢測了AfACO1在抽薹39 d后的成株的各生殖器官中的相對表達量，發現除了心皮外，其他各組織中AfACO1的表達量均很低(圖6-B)。

黃色矩形代表外顯子，黑色實線代表內含子 Yellow rectangles and black solid lines indicate exons and introns, respectively; AfACO1.蜻蜓鳳梨 ACO1 ACO1 of Aechemia fasciata； AtACO1.擬南芥 ACO1 ACO1 of Arabidopsis thaliana； AtACO2 .擬南芥 ACO2 ACO2 of Arabidopsis thaliana； AtACO4 .擬南芥 ACO4 ACO4 of Arabidopsis thaliana； AtACO5.擬南芥 ACO 5 ACO5 of Arabidopsis thaliana；LOC_Os08g30240.1.水稻的ACO1-like ACO1-like of Oryza sativa spp. japonica cv.Nipponbare；LOC_Os09g39720.1.水稻的ACO1-like ACO1-like of Oryza sativa spp. japonica cv.Nipponbare

圖3 AfACO1分子的進化樹構建Fig.3 Phylogenetic analysis of AfACO1 and ACO proteins of other species

紅色矩形處為亞鐵離子結合位點，藍色橢圓處為抗壞血酸結合位點 Red rectangles indicate the binding site of Fe2+, and the blue oval indicates the binding site of ascorbic acid

不同顏色的矩形代表不同的基序 The color boxes represent different putative motifs

A. AfACO1在蜻蜓鳳梨幼株、成株和抽薹39 d后的成株(39-day-after-flowering(DAF) adult plants)各組織中的相對表達量 Relative expression of AfACO1 in variable tissues of juvenile plants, adult plants before flowering, and 39-day-after-flowering(DAF) adult plants；B. AfACO1在抽薹39 d后的成株營養器官和生殖器官中的相對表達量 Relative expression of AfACO1 in vegetative and reproductive organs of 39 day adult plants

2.4 AfACO1對外源乙烯處理的響應特性

外源乙烯可通過啟動內源乙烯合成來促進鳳梨科植物開花。為了檢測AfACO1是否是內源乙烯合成的關鍵酶，通過施加不同質量濃度的外源乙烯利后，檢測蜻蜓鳳梨成株心葉中AfACO1轉錄本的相對表達量變化。由圖7可知，AfACO1的表達在乙烯利處理的4 h內幾乎無變化，但是隨后顯著受乙烯利誘導，表達量持續上升。有意思的是，AfACO1的表達似乎不受外源乙烯利質量濃度的影響。

圖7 施加不同質量濃度乙烯利后蜻蜓鳳梨成株心葉中 AfACO1的相對表達量Fig.7 Relative expression of AfACO1 in central leaves of Aechmea fasciata adult plants treated with exogenous ethephon

3 討 論

作為一種氣態激素，乙烯調控植物生長發育的諸多方面，包括開花[18-19]。乙烯可以通過赤霉素途徑增加DELLA蛋白的累積，從而抑制擬南芥開花[18]。與對擬南芥的作用相反，外源乙烯可以促進鳳梨科植物開花。到目前為止，已挖掘到部分響應乙烯或乙烯信號通路調控鳳梨科植物開花的基因[20-21]。此外，沉默乙烯合成途徑中的一個限速酶ACACS2后，菠蘿開花顯著延遲[22]。

ACO是乙烯合成途徑中的最后一個酶，也是除了ACS外的另一個限速酶，對底物有高度的專一性。1985年，調控番茄果實成熟的基因pTOM13被克隆，并最終在1991年被鑒定為乙烯形成酶(Ethylene-forming enzyme，EFE)基因，即ACO，這也是第一個被克隆的ACO基因[23-26]。目前，除番茄外，ACO基因已經在擬南芥、蘋果、甜瓜、黃瓜、桃、油棕等多種植物中被克隆[27-32]，但尚未見鳳梨科植物中ACO基因克隆和功能鑒定的報道。

本研究首次從蜻蜓鳳梨中克隆了一個ACO基因，并將其命名為AfACO1。相對而言，AfACO1的基因序列長度較短(圖2)，且只有一個內含子，結構與擬南芥中的ACOs均不一樣(圖2)。但是AfACO1的蛋白序列中有高度保守的Fe2+離子結合位點以及抗壞血酸結合位點(圖4)。晶體結構解析結果證實，這2個位點是ACO利用抗壞血酸為底物、CO2為激活子、Fe2+為輔因子來合成乙烯的關鍵結構[33-37]。此外，結構域分析結果發現，AfACO1具有與擬南芥和水稻的ACOs類似的保守基序(圖5)。這些結果表明，AfACO1可能是個功能性的ACO，在乙烯合成過程中起重要作用。

ACOs是家族基因，例如，番茄中有6個ACOs[38]，黃瓜中發現了 5個ACOs[31, 39]，蘋果中有3個ACOs[30]。不同物種或同一物種的不同ACOs的時空表達模式不盡相同。番茄的LeACO1主要在花的翼瓣和柱頭表達，LeACO2只在花藥中表達，LeACO3則是除了萼片外，在其他花組織中均表達。此外，在果實成熟期，LeACO1的表達顯著升高；LeACO3的表達則在果實躍變期，而LeACO4則在整個果實成熟期均表達[40]。為了更好地探究AfACO1可能的功能，筆者檢測了其在蜻蜓鳳梨生長發育各個階段的各營養器官和生殖器官中的轉錄本表達量。AfACO1在幼株和開花前的成株大部分器官中的表達模式類似，即在外葉中的表達量相對較高，而在心葉和莖中表達量很低或檢測不到其表達(圖6-A)。但在抽薹39 d的成株中，AfACO1的表達量在莖中升高了，而在心葉中則顯著上升，甚至遠遠高于各生長階段外葉中的表達量(圖6-A)。這種在花發育時期的營養器官中的高表達模式暗示，AfACO1可能是生殖生長階段乙烯合成的關鍵酶。

ACO基因的表達也受乙烯、脫落酸等激素以及非生物脅迫的誘導。例如，脫落酸處理可以誘導番茄LeACO1的表達[41]，水楊酸能顯著下調桃果實中PpACO1的表達，顯著上調PpACO2的表達[28]，而生長素能完全抑制乙烯誘導后的水稻OsACO3的表達[42]。自20世紀30年代以來，利用乙烯或乙烯衍生物促進鳳梨科植物開花就已經成為生產者普遍采用的措施。研究表明，施加外源乙烯促進內源乙烯的合成，進而促進鳳梨科植物開花[14-17]。為了探究AfACO1對外源乙烯處理的響應，筆者使用不同質量濃度的乙烯利對蜻蜓鳳梨成株進行灌心處理。由圖7可知，在外源乙烯利處理的4 h內，AfACO1的表達幾乎沒有變化。前期筆者曾發現，乙烯下游的一個調控開花的基因AfAP2-1可以在外源乙烯處理的1 h即迅速下調[20]。這表明，除了AfACO1外，蜻蜓鳳梨中可能還存在其他的ACO同源基因可以迅速響應外源乙烯利的處理，促進內源乙烯的合成，進而通過乙烯信號通路調控下游開花相關基因的表達。

從外源乙烯利處理8 h開始，AfACO1的表達逐漸上調，表明AfACO1在乙烯后期的合成中發揮著重要作用。更有趣的是，不同質量濃度的乙烯利處理后，AfACO1的表達模式均很相似，且同一時間點的相對表達量也近乎相同(圖7)，表明一次性施加20 mL 0.3 g/L的外源乙烯利，已經達到誘導AfACO1表達的閾值，更高質量濃度的乙烯利處理并不能通過提高AfACO1的表達來促進內源乙烯的合成。

盡管乙烯促進鳳梨科植物開花顯而易見，但分子機制遠未闡明。ACO是調控內源乙烯合成的家族基因，因此，克隆更多的蜻蜓鳳梨ACO基因，研究它們的時空表達模式以及編碼蛋白酶的生物學功能，結合基因工程手段最終探究ACO在乙烯誘導鳳梨科植物開花中的作用，將是今后研究的重要方向之一。