復方人參皂苷納米乳對OVA接種小鼠免疫功能的影響

曹發昊，張百勝，王艷萍，歐陽五慶

(1. 運城學院 生命科學系，山西運城 044000；2.鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044；3. 西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100)

人參(PanaxginsengC. A. Mey)是一種藥食兩用的藥用植物，具有抗腫瘤、抗疲勞、增強免疫力及抗衰老等功效[1-2]，人參皂苷(Ginsenoside，GS)是其發揮功效的重要成分之一，皂苷是一種很好的免疫調節劑，可用于防治人類或動物疾病[3-4]。納米乳(Nanoemulsion，NE)是油和水在表面活性劑和(或)助表面活性劑作用下形成的一種穩定透明的膠體分散系，具有藥物載體的多種優勢[5]。人參皂苷具有表面活性劑的性質，能和某些成分作用形成粒徑10～100 nm的納米乳，筆者前期用人參皂苷和鹽酸左旋咪唑(Levamisole Hydrochloride，LH)成功制備粒徑23.08 nm的復方人參皂苷納米乳，并對其急性毒性進行研究[6]。為了研究口服復方人參皂苷納米乳對抗原免疫效果的影響，本研究給小鼠皮下注射卵清白蛋白(OVA)抗原 2 次，在首次和第 2 次注射前連續灌胃給予相應藥物，通過檢測血清抗體水平、脾細胞因子水平和脾淋巴細胞增殖能力，確定復方人參皂苷納米乳對OVA免疫效果的影響，為復方人參皂苷納米乳免疫增強劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑 人參皂苷(陜西浩洋生物科技有限公司)，鹽酸左旋咪唑(山東弘揚獸藥原料有限公司)，卵清白蛋白OVA(北京智杰方遠科技有限公司)，MTS試劑盒(艾美捷科技有限公司)，TMB顯色液(上海碧云天生物技術有限公司)，HRP標記羊抗小鼠IgG(上海遠慕生物科技有限公司)，HRP標記羊抗小鼠IgG1(上海羽朵生物科技有限公司)，HRP標記羊抗小鼠IgG2a抗體(上海北諾生物科技有限公司)，IL-4 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)，IFN-γ ELISA試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)。

空白納米乳組成：表面活性劑Solutol○RHS-15占25.33%，聚乙二醇400占2.53%，甘油占10.14%，肉豆蔻酸異丙酯占2.53%，蒸餾水占56%。

復方人參皂苷納米乳組成：空白納米乳中加入人參皂苷和鹽酸左旋咪唑，使其質量濃度分別為30.15和30.04 mg·mL-1。

鹽酸左旋咪唑納米乳：空白納米乳中加入鹽酸左旋咪唑，使其終質量濃度為30.04 mg·mL-1。

人參皂苷納米乳：空白納米乳中加入人參皂苷，使其終質量濃度為30.15 mg·mL-1。

人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液：蒸餾水中加入人參皂苷和鹽酸左旋咪唑，使其終質量濃度分別為30.15和30.04 mg·mL-1。

1.1.2 儀器 雷磁 PHS-25 數顯酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，HORIBA SZ-100納米粒度/Zeta電位分析儀(上海巨納科技有限公司)，DNM-9606酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)，倒置顯微鏡(上海光學儀器一廠)，ZWC-08磁力攪拌器(金壇市鴻科儀器廠)。

1.1.3 試驗動物 成年Balb/c小鼠，體質量為22～25 g，購于第四軍醫大學實驗動物中心。

1.2 方 法

1.2.1 復方人參皂苷納米乳的制備 按照文獻[6]確定的復方人參皂苷納米乳配方，先將人參皂苷、表面活性劑和助表面活性劑于磁力攪拌器中(450 r·min-1，25 ℃)混合均勻，然后加入油相繼續攪拌混勻，最后緩慢滴加溶解鹽酸左旋咪唑的蒸餾水，攪拌直至形成黃色澄清的復方人參皂苷納米乳。

1.2.2 小鼠分組與給藥 小鼠90只，分為9組，每組10只，雌雄各半。具體分組如下：正常對照組(給予生理鹽水)、OVA對照組(給予生理鹽水)、空白納米乳組(給予空白納米乳)、鹽酸左旋咪唑納米乳組(給予25 mg·kg-1鹽酸左旋咪唑納米乳)、人參皂苷納米乳組(給予25 mg·kg-1人參皂苷納米乳)、人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組(給予50 mg·kg-1人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液)、復方人參皂苷納米乳高、中、低劑量組(分別給予100、50、25 mg·kg-1復方人參皂苷納米乳)。其中人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液和復方人參皂苷納米乳中人參皂苷和鹽酸左旋咪唑質量比為1∶1。

小鼠(除正常對照組外)皮下注射OVA抗原100 μg，注射 2 次，間隔2 周，每只小鼠分別于首次和第 2 次注射前3 d連續灌胃給予相應藥物，每天1次，灌胃量均為0.4 mL。第 2 次注射后14 d，采集全血和脾臟組織，用于后續試驗。

1.2.3 血清抗體水平測定 參照試劑盒說明，采用間接ELISA法測定IgG、IgG1和IgG2a血清抗體水平[7]。

1.2.4 脾細胞因子IFN-γ和IL-4測定 無菌條件下，脾臟處理后用培養液制備5×106mL-1脾細胞懸液。96孔板中每孔加入100 μL脾細胞懸液，再加入OVA抗原(終質量濃度為100 μg·mL-1)，培養48 h后，取上清，按試劑盒說明檢測IL-4和IFN-γ水平。

1.2.5 脾淋巴細胞增殖能力測定 96孔板中加入5×106mL-1脾細胞懸液(每孔100 μL)，再加入100 μL培養液，加入OVA使其終質量濃度為10 μg·mL-1。設空白對照組(只加培養液)、陰性對照組(加細胞和培養液，不加OVA)，培養44 h 后加入MTS，繼續培養4 h后酶標儀測定OD490值，計算增殖刺激指數SI。

SI=加抗原培養物OD490/不加抗原培養物OD490

2 結果與分析

2.1 復方人參皂苷納米乳對小鼠血清IgG抗體水平的影響

由表1可知，空白納米乳組IgG抗體水平與OVA對照組差異不顯著(P>0.05)。復方人參皂苷納米乳中劑量組極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)，顯著高于復方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，與人參皂苷納米乳組、復方人參皂苷納米乳高劑量組和人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 復方人參皂苷納米乳對小鼠IgG1和IgG2a血清抗體水平的影響

由表1可知，空白納米乳組IgG1和IgG2a抗體水平與OVA對照組差異不顯著(P>0.05)。復方人參皂苷納米乳中劑量組IgG1抗體水平極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)，顯著高于復方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，與人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組、人參皂苷納米乳組和復方人參皂苷納米乳高劑量組差異不顯著(P>0.05)。復方人參皂苷納米乳中劑量組IgG2a抗體水平顯著高于復方人參皂苷納米乳高劑量組、人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組和復方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組和人參皂苷納米乳組(P<0.01)。

2.3 復方人參皂苷納米乳對OVA誘導小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

由表2可知，空白納米乳組SI值與OVA對照組差異不顯著(P>0.05)。復方人參皂苷納米乳中劑量組SI值顯著大于人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組和復方人參皂苷納米乳高劑量組(P<0.05)，極顯著大于人參皂苷納米乳組、復方人參皂苷納米乳低劑量組和鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)。

表1 OVA接種小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a抗體水平Table 1 Level of serum antibodies IgG, IgG1, IgG2a in OVA-inoculated mice

注：與OVA對照組比較， a和A分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。與復方人參皂苷納米乳中劑量組比較， b和B分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。數據用“平均數±標準差”表示。下同。

Note: Compared with OVA control group, the shoulder characters a and A mean significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively. Compared with GS-LH-NE medium dosage group, the shoulder characters b and B mean significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively.Date are “average±standard deviation”.The same below.

表2 OVA接種小鼠脾淋巴細胞增殖刺激指數Table 2 Proliferation stimulating index of splenic lymphocytes in OVA-inoculated mice

2.4 復方人參皂苷納米乳對小鼠脾細胞因子IL-4和IFN-γ水平的影響

由表3可知，空白納米乳組IL-4和IFN-γ水平與OVA對照組差異不顯著(P>0.05)。復方人參皂苷納米乳中劑量組IL-4水平顯著高于復方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)，與復方人參皂苷納米乳高劑量組、人參皂苷納米乳組及人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組差異不顯著(P>0.05)。復方人參皂苷納米乳中劑量組IFN-γ水平顯著高于人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組、復方人參皂苷納米乳高劑量組和復方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，極顯著高于人參皂苷納米乳組和鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)。

3 討 論

疫苗在機體抵御疾病方面發揮重要作用，有些疫苗單獨使用就能達到目的，但有些疫苗的免疫原性弱，需要佐劑或免疫增強劑來改善疫苗的免疫原性，佐劑或免疫增強劑可以通過注射、口服或黏膜等多途徑給藥。Zhai等[8]研究發現，在雞接種ND活疫苗前，口服劑量為5 g·kg-1人參莖葉皂苷溶液能顯著提高ND活疫苗免疫雞的血清HI抗體滴度、淋巴細胞增殖反應和IgA+ B細胞數量。Yu等[9]發現在接種ND疫苗和禽流感疫苗前，口服人參莖葉皂苷能恢復環磷酰胺免疫抑制雞ConA和LPS誘導的脾細胞增殖能力，增加腸上皮內淋巴細胞和IgA+ B細胞的數量，促進特異性抗體產生。在一些免疫試驗中，常用小鼠、豚鼠、家兔作為動物模型，OVA作為模式抗原，來研究機體的免疫功能[10]。本研究用小鼠作為試驗動物，皮下注射OVA抗原，灌胃復方人參皂苷納米乳，研究口服復方人參皂苷納米乳對OVA免疫效果的影響。IFN-γ、IgG2a和 IL-4、IgG1分別反映Th1和Th2的免疫功能，Th1免疫主要由Th1細胞介導的細胞免疫，Th2免疫主要由Th2細胞介導的體液免疫，故通過測定IFN-γ、IgG2a、IL-4和IgG1這 4 個指標可以反映機體的細胞免疫和體液免疫功能[11-13]。結果發現，口服復方人參皂苷納米乳中劑量組IL-4、IgG和IgG1水平顯著或極顯著高于復方人參皂苷納米乳低劑量組和鹽酸左旋咪唑納米乳組，IFN-γ、IgG2a和OVA誘導脾細胞增殖刺激指數顯著或極顯著高于人參皂苷納米乳組、人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組、鹽酸左旋咪唑納米乳組及復方人參皂苷納米乳高劑量組和低劑量組。口服復方人參皂苷納米乳能增強OVA誘導小鼠的細胞免疫和體液免疫功能，產生Th1/Th2混合型免疫反應，其中中劑量(50 mg·kg-1)作用較強。復方人參皂苷納米乳口服增強免疫效果優于人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液，這可能是由于：鹽酸左旋咪唑存在于水相中，而人參皂苷具有表面活性劑的性質，能起到類似表面活性劑Solutol○RHS-15作用，參與形成納米乳液滴界面膜，實現其納米化和藥物儲存庫的功效[14]；復方人參皂苷納米乳平均粒徑為23.08 nm，粒徑小、表面積大，且其zeta電位(-31.6 mV)小于0，有利于液滴和細胞相互作用，改善藥物的吸收和分布[15]。口服復方人參皂苷納米乳對小鼠非特異性免疫功能的影響有待后續研究。

表3 OVA接種小鼠脾細胞因子IL-4和IFN-γ質量濃度Table 3 Level of splenocyte cytokines IL-4 and IFN-γ in OVA-inoculated mice

4 結 論

口服復方人參皂苷納米乳能誘導OVA免疫小鼠產生Th1/Th2混合型免疫反應，表明人參皂苷和鹽酸左旋咪唑能協同增強小鼠的細胞免疫和體液免疫功能，該結果為開發復方人參皂苷納米乳免疫增強劑提供依據。